張舒文，李曉飛，于洪丹，郭蓮怡

0 引言

原發(fā)性肝癌是全球第六大常見癌癥，也是癌癥死亡的第二大常見原因[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年，全球約增加84.1萬新病例，約78.2萬人死亡[2]。目前，外科手術(shù)仍是傳統(tǒng)的治療方法。由于其高侵襲性，大多數(shù)病例在確診時(shí)已進(jìn)展到中晚期，錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)[3]。肝癌死亡率與發(fā)病率之比為0.95，說明預(yù)后極差[4]。因此，開發(fā)新的抗癌藥物是研究的熱點(diǎn)。

CA3又稱CIL56，是一種新的YAP1（yes相關(guān)蛋白1）靶向抑制劑，CA3對YAP1轉(zhuǎn)錄活性的明顯抑制，使其能夠抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、減少腫瘤球的形成[5]?，F(xiàn)已證明，CA3可以在相對較低的濃度下抑制食管腺癌[5]和胃腺癌細(xì)胞[6]的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且無明顯毒性。目前關(guān)于CA3在肝癌中的作用機(jī)制仍未得到充分研究，因此本實(shí)驗(yàn)以肝癌HepG2細(xì)胞為研究對象，探討CA3對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肝癌HepG2細(xì)胞由錦州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；CA3購自上海藍(lán)木化工有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司；增強(qiáng)型CCK-8試劑盒購自上海尚寶生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京碧波生物科技有限公司；活性氧檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；YAP1抗體購自沈陽萬類生物公司；Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Proteintech公司。

儀器：細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)（Cytation5，美國BioTek公司），流式細(xì)胞儀（Novo-Cyte，美國ACEA公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次并觀察細(xì)胞的變化。

1.2.2 增強(qiáng)型CCK-8試劑盒檢測HepG2細(xì)胞的增殖 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，分別以每孔1×104個(gè)接種于96孔板中，每孔100 μl，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入藥物。使CA3終濃度為0、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，加藥后分別培養(yǎng)24和48 h。每孔加入10 μl增強(qiáng)型CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱孵育1～4 h，于490 nm處測定OD值。細(xì)胞活力（%）=（OD加藥細(xì)胞-OD空白）/（OD對照細(xì)胞-OD空白）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測CA3對HepG2細(xì)胞凋亡的影響 分別收集0、0.5、1.0和2.0 mmol/L CA3作用48 h的HepG2細(xì)胞，取1×105個(gè)細(xì)胞，按說明處理細(xì)胞：PBS洗滌細(xì)胞2次；加入500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞；分別加入5 μl Annexin V-FITC和PI室溫避光染色10 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞凋亡率，同一實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.2.4 活性氧（ROS）含量檢測 用無血清培養(yǎng)液按1:1000稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 mmol/L。取0、0.5、1.0和2.0 mmol/L CA3作用48 h的HepG2細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，加入適量的DCFH-DA，充分蓋住細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱孵育20 min，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，于488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長，采用細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧含量，放大倍數(shù)4倍。同一實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot法檢測YAP1、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白水平 用0.5、1.0和2.0 mmol/L的CA3處理細(xì)胞48 h，胰酶消化細(xì)胞后收集適量細(xì)胞。提取蛋白后，BCA蛋白濃度定量。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)模、BSA封閉2 h后加一抗，于4℃孵育過夜。TBST洗3次，5分鐘/次，加二抗，室溫孵育1 h，ECL顯影。同一實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，Image-J軟件分析條帶結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組樣本之間的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CA3對HepG2細(xì)胞增殖的影響

CA3對細(xì)胞作用相同時(shí)間后，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞增殖率下降。0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L的CA3作用HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖率分別為（80.5±0.3）%、（79.4±0.2）%、（76.2±0.2）%、（76.4±0.1）%和（49.3±0.4）%；作用48 h后，細(xì)胞增殖率分別為（75.3±0.2）%、（64.8±0.3）%、（48.4±0.2）%、（32.2±0.4）%和（31.9±0.2）%。2.0 mmol/L CA3作用細(xì)胞24和48 h后，與0 mmol/L組比較，細(xì)胞增殖率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034,P=0.000），見圖1。圖中顯示，CA3作用48 h后，組內(nèi)差異顯著，為進(jìn)一步探討其機(jī)制，選擇0.5、1.0和2.0 mmol/L三個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 CA3誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

圖1 不同濃度CA3作用24和48h后對HepG2細(xì)胞增殖率的影響Figure 1 Proliferation rate of HepG2 cells after different concentrations of CA3 treatment for 24 and 48h

不同濃度CA3作用HepG2細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增加細(xì)胞凋亡率增加，見圖2。2.0 mmol/L CA3作用HepG2細(xì)胞48 h后，凋亡率由0 mmol/L的15.56%增加到2.0 mmol/L的58.48%，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；其中晚期凋亡率由0 mmol/L的11.32%增加到2.0 mmol/L的41.46%，兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化

不同濃度CA3作用HepG2細(xì)胞48 h后，隨著CA3藥物濃度增加，細(xì)胞內(nèi)ROS的含量明顯增加。結(jié)果表明，與0 mmol/L組相比，CA3能促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，見圖3。

2.4 藥物對YAP1、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.0mmol/L的CA3作用HepG2細(xì)胞48 h后，Western blot法檢測結(jié)果顯示，與0 mmol/L組相比，YAP1（P=0.007）、Bcl-2（P=0.000）表達(dá)降低，Bax（P=0.000）、Caspase-3（P=0.000）表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

3 討論

現(xiàn)如今，如何通過藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為藥物研發(fā)的熱點(diǎn)，細(xì)胞凋亡機(jī)制也將成為惡性腫瘤治療及預(yù)后的研究重點(diǎn)。由于大多數(shù)抗癌藥物在血液循環(huán)中的半衰期短，水溶性較差，化療效果并不如預(yù)期理想[7]，因此，尋找改善預(yù)后及降低不良反應(yīng)的新型藥物對于肝癌治療研究有著極為重要的意義。

目前抗肝癌藥物研究中，脂聯(lián)素通過調(diào)控硫氧還蛋白表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[8]，而吳茱萸堿可通過抑制肝癌細(xì)胞中的Akt信號通路來誘導(dǎo)凋亡[9]，華蟾毒它靈則是通過產(chǎn)生神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡[10]。與上述藥物相比，在Li等[11]的研究中發(fā)現(xiàn)，YAP1抑制劑CA3在相對較低濃度下即對食管癌細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤作用，且毒性較小。當(dāng)CA3和CDK6抑制劑LEE001聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，效果更佳。本實(shí)驗(yàn)通過增強(qiáng)型CCK-8檢測顯示，CA3在較低的濃度下對肝癌細(xì)胞的增殖也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用且其毒性較小。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，隨著CA3濃度增加，其凋亡率也明顯增加。

圖2 不同濃度CA3作用HepG2細(xì)胞48h后對細(xì)胞凋亡率的影響Figure2 Apoptosis of HepG2 cells after different concentrations of CA3 treatment for 48h

圖3 不同濃度CA3作用HepG2細(xì)胞48h后細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的變化Figure 3 Content of intracellular reactive oxygen species(ROS) in HepG2 cells after different concentrations of CA3 treatment for 48 h

圖4 不同濃度CA3作用HepG2細(xì)胞48h后，YAP1、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)變化Figure 4 Expression of YAP1,Bcl-2,Bax and Caspase-3 protein in HepG2 cells after different concentrations of CA3 treatment for 48 h

Hippo通路是一種保守的、參與組織發(fā)育和再生的進(jìn)化信號通路，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡[12]。YES相關(guān)蛋白1（YAP1）是Hippo通路中最具特征的核心效應(yīng)蛋白[13]，在多種癌細(xì)胞中廣泛而頻繁地過表達(dá)，具有調(diào)控細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡的作用[14]。YAP1的過表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌和胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)[15]。研究證實(shí)，YAP1已成為一種新的生物標(biāo)志物，是一種潛在的肝癌治療靶點(diǎn)。在Zhang等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)，YAP1在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于其正常組織，YAP1的下調(diào)使肝癌細(xì)胞增殖減少，凋亡增加。這與本研究結(jié)果一致，CA3通過抑制YAP1的表達(dá)可抑制肝癌的增殖，促進(jìn)其凋亡。

YAP1還被證明可以介導(dǎo)許多致癌信號通路，如PI3K-mTOR[17]、KRAS/EGFR[18]、g蛋白偶聯(lián)受體[19]和Wnt/β-catenin[20]等。Bcl-2家族蛋白是研究細(xì)胞凋亡通路時(shí)最常見的蛋白之一，大量實(shí)驗(yàn)已證明它可調(diào)控細(xì)胞的凋亡。Bcl-2家族可分為抗凋亡的Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1和促凋亡的Bax、Bak、Bad蛋白。Bcl-2家族蛋白，可以通過控制線粒體膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，啟動Caspase參與的凋亡[21]。Caspase-3是外源性和內(nèi)源性凋亡途徑的中心節(jié)點(diǎn)，驅(qū)動細(xì)胞凋亡的最終形成[22]。細(xì)胞凋亡過程中，Bax可進(jìn)入線粒體，形成通道使細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活Caspase-3從而發(fā)揮其促凋亡作用[23]。而抗凋亡Bcl-2和Bcl-xL蛋白可通過維持線粒體膜的完整性阻止Caspase-3的激活[24]。因此，抑制Bcl-2、促進(jìn)Bax、Caspase-3的表達(dá)，可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。為探究CA3是否影響B(tài)cl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)用Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，隨著CA3濃度的增加，Bcl-2的表達(dá)降低，Bax和Caspase-3的表達(dá)升高，最終肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，證實(shí)了CA3的抗腫瘤作用。

在癌細(xì)胞內(nèi)，ROS的適度增加促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖，而高水平的ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。有研究證明，ROS濃度升高可促進(jìn)肝癌細(xì)胞[26]、膀胱癌細(xì)胞[27]、膠質(zhì)瘤細(xì)胞[28]的凋亡，ROS的增加也可促進(jìn)Caspase-3的激活，從而參與誘導(dǎo)凋亡[28]。因此，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，是一種潛在的癌癥治療方法。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CA3的濃度增加時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS的含量也明顯增加，肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了CA3的抗腫瘤作用。

綜上所述，CA3可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制YAP1及調(diào)控Bcl-2蛋白家族的表達(dá)，使YAP1、Bcl-2蛋白表達(dá)降低、Bax和Caspase-3的表達(dá)升高有關(guān)，同時(shí)ROS的升高也可能參與細(xì)胞凋亡。本研究旨在證明CA3可能是潛在有價(jià)值的肝癌治療藥物，未來可進(jìn)一步研究其在體內(nèi)對肝癌細(xì)胞的影響，并探討CA3與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用的療效。