劉立，蓋金娜，尹作文，陳琴華

0 引言

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位居全球腫瘤發(fā)病率和死亡率的第二位[1-2]。胃癌的早期診斷率低，臨床診治時常被延誤[2-3]。腫瘤標志物的出現(xiàn)為早期胃癌的診斷帶來了新的希望[4-5]。雖然目前已發(fā)現(xiàn)多種用于胃癌檢測的腫瘤標志物，但其特異性均不高，敏感度也不甚理想[6]。晚期胃癌患者的臨床治療手段仍以化療為主，至今仍沒有公認的治療標準[7-8]。近些年，免疫治療已成為腫瘤研究的熱點，多項研究提示免疫治療在未來的腫瘤治療中有巨大前景[8-10]。報道指出，多種細胞因子在腫瘤免疫中發(fā)揮作用，已被用于腫瘤的免疫治療[11-12]。CXC趨化因子配體-5（CXC chemokine ligand-5,CXCL5），又稱為上皮中性粒細胞活化肽78（ENA78），是CXC趨化因子家族的成員之一[13-14]。作為炎性介質(zhì)，CXCL5對中性粒細胞有很強的趨化作用[15]。此外，CXCL5可與其特異性受體CXCR2結(jié)合，介導一系列生物學效應進而影響腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[15]。研究指出，CXCL5與非小細胞肺癌、膀胱癌、肝癌等的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[16-19]。而CXCL5在胃癌中的確切作用機制尚無報道，本研究探討CXCL5對胃癌腫瘤免疫的影響及其潛在分子機制。

1 資料與方法

1.1 資料來源

本研究共納入華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院胃腸外科于2018年7月—2019年4月收治的83例胃癌患者作為研究對象進行回顧性研究；患者年齡在23～79歲之間，平均年齡51.3±13.8歲；所有患者中男55例、女28例。所有患者均為首次被診斷為胃癌，均經(jīng)病理學或影像學（或內(nèi)鏡）確診。排除復發(fā)性胃癌患者、放化療史的患者、并發(fā)其他惡性腫瘤的患者、近期服用影響機體免疫藥物的患者、伴有全身感染性疾病的患者、臨床資料不全無法進行統(tǒng)計的患者、伴有嚴重臟器功能障礙的患者、妊娠期或哺乳期女性。胃癌患者的基本信息見表1。

另選取同期在我院體檢科體檢的健康者40 例作為對照；年齡在29～67 歲之間，平均年齡48.6±14.1歲，其中男27例、女13例。兩組年齡與性別相比差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），有可比性。所有納入者均簽署知情同意書，均知曉本研究的目的與方法，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 83例胃癌患者的基本信息Table 1 Basic data of 83 gastric cancer patients

1.2 材料與設備

DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素（美國Hyclone公司）。人胃癌細胞株SNU216和小鼠胃癌細胞株MFC購自武漢大學細胞庫。Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Thermo Fisher公司）。小鼠淋巴細胞分離液（深圳達科為生物技術(shù)有限公司）。人CXCL5 ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。重組人CXCL5蛋白（上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司）。SDS-PAGE試劑（上海生工生物工程股份有限公司）。CXCL5抗體、CXCR2抗體、p-ERK1/2抗體、p-MAPK抗體、p-β-catenin抗體（美國Santa Cruz公司）；p-PI3K抗體、p-AKT抗體、p-NF-κB抗體（美國CST公司）；MAPK抗體、PI3K抗體、NF-κB抗體、β-catenin抗體（美國Abcam公司）；ERK1/2抗體、AKT抗體、β-actin抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。NF-κB信號通路抑制劑BAY 11-7082（美國MCE公司），Wnt/β-catenin信號通路抑制劑XAV939（美國Selleckchem公司）。流式細胞術(shù)抗體：FITC標記的CD4抗體、APC標記的CD8抗體、FITC標記的CD56抗體、PE標記的CD16抗體（美國BioLegend公司）。pLVX-Tight-Puro質(zhì)粒（美國Invitrogen公司）。Taq酶（武漢擎科生物技術(shù)有限公司）。內(nèi)切酶BamHⅠ與EcoRⅠ（美國Thermo Fisher公司）。T4 DNA連接酶（日本TaKaRa公司）。C57小鼠購自武漢大學實驗動物中心。主要設備有生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、垂直電泳儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)、流式細胞儀、Tecan酶標儀等。

1.3 酶聯(lián)免疫檢測CXCL5水平

分別抽取胃癌患者和健康者的空腹靜脈血10 ml，置于促凝管中，自然凝固，2600 r/min離心15 min，取上清液儲存于-80℃?zhèn)溆谩XCL5 ELISA試劑盒檢測血清中CXCL5的水平，檢測過程嚴格按照產(chǎn)品說明書進行。用Tecan酶標儀測量450 nm處的OD值。繪制標準曲線，計算CXCL5濃度。

1.4 Western blot檢測 CXCL5、CXCR2及NF-κB、β-catenin、ERK和PI3K/AKT信號通路

取新鮮或-80℃凍存的患者腫瘤組織、癌旁正常組織和小鼠腫瘤組織，碾磨后用含cocktail蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進行裂解，超聲后12000 r/min離心，取上清液即為總蛋白。貼壁細胞用PBS潤洗，吸棄后加入含cocktail蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進行裂解，收集裂解液，超聲后12000 r/min離心，取上清液即為總蛋白。組織與細胞樣品的蛋白濃度均用BCA試劑盒進行測定。SDS-PAGE電泳用5%的濃縮膠與12%的分離膠進行，每孔上蛋白樣80～100 μg。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%BSA封閉，一抗4℃孵育過夜。洗滌，二抗室溫孵育，洗滌，DAB顯色。

1.5 免疫組織化學染色檢測CXCL5與CXCR2

采用SP法檢測胃癌患者腫瘤及癌旁正常組織中CXCL5與其受體CXCR2的表達。將10%甲醛溶液固定過夜的組織進行石蠟包埋與切片，所有切片常規(guī)脫蠟至水，加0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH6.0），用高壓鍋進行抗原熱修復，加3%H2O2室溫避光孵育30 min，PBS洗滌3次。滴加10%的正常非免疫羊血清，37℃孵育60 min，PBS洗滌3次。滴加CXCL5或CXCR2一抗工作液（稀釋比例為1:50），4℃孵育過夜，PBS洗滌3次。滴加二抗工作液（稀釋比例為1:200），37℃孵育60 min，PBS洗滌3次。滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉卵白素，37℃孵育60 min，PBS洗滌3次。用DAB顯色、蘇木精對比染色、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，每個切片隨機選取5個視野進行拍照。用Image Pro Plus軟件計算陽性染色的平均吸光度。

1.6 質(zhì)粒構(gòu)建與穩(wěn)定表達細胞株建立

根據(jù)人CXCL5的mRNA序列（NM_002994.5）和pLVX-Tight-Puro載體圖譜，設計引物序列，上游引物：5’-CCGGGATCCATGAGCCTCCTGTCCAGC-3’（BamHⅠ）；下游引物：5’-CCCGGTAGAATTCGTTTTCCTTGTTTCCACC-3’（EcoRⅠ）。從人胃癌細胞株SNU216中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)Taq酶的說明書進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)鑒定、純化后備用。用BamHⅠ和EcoRⅠ酶對pLVX-Tight-Puro質(zhì)粒進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)鑒定、純化后備用。根據(jù)T4連接酶的說明書將cDNA擴增產(chǎn)物與酶切質(zhì)粒進行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化與鑒定后提取質(zhì)粒備用。pLVX-CXCL5質(zhì)粒構(gòu)建成功后根據(jù)pLVX-Tight-Puro的說明書包裝慢病毒。慢病毒感染SNU216或MFC細胞，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達CXCL5的細胞。

1.7 小鼠移植瘤模型的建立

將30只C57小鼠隨機分為CXCL5過表達組和對照組，每組15只。將對數(shù)期生長的穩(wěn)定過表達CXCL5或?qū)φ招∈笪赴㎝FC細胞消化、離心、PBS重懸、計數(shù)后調(diào)整細胞濃度至1.0×107/ml，無菌條件下將細胞接種于C57小鼠左前肢腋窩結(jié)合部皮下，每只0.1 ml。接種后第3天起隔天記錄各小鼠的腫瘤大小，繪制腫瘤生長與生存曲線。用Western blot分析各組小鼠腫瘤組織中CXCL5、磷酸化NF-κB與磷酸化β-catenin的表達水平。分離小鼠胃癌移植瘤細胞。用流式細胞術(shù)檢測移植瘤中CD4+T細胞、CD8+T細胞與CD56+CD16+NK細胞比例。

1.8 流式細胞術(shù)檢測CD4+T、CD8+T與CD56+CD16+ NK細胞

分離小鼠胃癌移植瘤組織切塊，置于RPMI1640培養(yǎng)基中消化過夜、研磨、過不銹鋼網(wǎng)過篩，經(jīng)PBS洗滌后制成單細胞懸液，計數(shù)并將細胞濃度調(diào)整到1.0×107/ml，取0.5 ml細胞懸液加入離心管。根據(jù)抗體的使用說明書將待測抗體（CD4、CD8、CD56或CD16）以適當比例加入離心管中。渦旋混勻并將離心管置于避光處室溫孵育30 min。低速離心機1500 r/min離心5 min后棄上清液，并用PBS洗滌3次。再次棄上清液后加入0.3 ml的PBS重懸。渦旋混勻后上流式細胞儀進行檢測。

1.9 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)分析均采用SPSS20.0進行。采用Graph Pad Prism 5.0進行作圖。計數(shù)資料用頻數(shù)和百分比（n（%））表示，計量資料用均數(shù)±標準差（>）表示。采用t檢驗或Mann-Whitney U檢驗分析兩獨立樣本之間的差異，采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗進行計數(shù)資料分析。所有統(tǒng)計學分析均為雙尾檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者血清及組織中CXCL5水平分析

共納入83例胃癌患者。ELISA分析顯示胃癌患者的血清CXCL5水平為（263.1±37.9）ng/L，顯著高于健康者的（158.6±18.3）ng/L。Western blot與免疫組織化學分析顯示，胃癌患者腫瘤組織中的CXCL5及其受體CXCR2的水平均顯著高于癌旁正常組織，見圖1。

2.2 CXCL5水平與臨床特征的關(guān)系

根據(jù)患者腫瘤組織中CXCL5的表達水平，以所有患者的平均吸光度值為界限將所有患者分為CXCL5低表達組（CXCL5Low）與CXCL5高表達組（CXCL5High）。CXCL5低表達組26例、CXCL5高表達組57例。胃癌患者中CXCL5高表達與CXCL5低表達組的年齡、性別、組織學類型與漿膜浸潤相比差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。CXCL5高表達組患者的分化程度顯著低于CXCL5低表達組（P＜0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和TNM分期均顯著高于CXCL5低表達組（均P＜0.05），見表2。

2.3 CXCL5對胃癌細胞信號通路的影響

Western blot顯示CXCL5過表達能顯著增加SNU216與MFC細胞中p-NF-κB與p-β-catenin的表達水平，而不影響p-ERK、p-PI3K與p-AKT的表達水平，見圖2A。進一步分析顯示，重組CXCL5蛋白（rCXCL5）也能顯著增加SNU216與MFC細胞中p-NF-κB與p-β-catenin的表達水平，見圖2B。

2.4 小鼠模型的建立與分析

與對照組相比，CXCL5過表達組胃癌移植瘤小鼠的腫瘤體積顯著增高（P＜0.05），見圖3A；生存期顯著降低（P=0.006），見圖3B。Westernblot結(jié)果顯示CXCL5過表達組中CXCL5、p-NF-κB與 p-β-catenin的表達水平均顯著高于對照組，見圖3C。流式分析結(jié)果顯示CXCL5過表達組中CD4+T細胞、CD8+T細胞與CD56+CD16+NK細胞數(shù)量均顯著低于對照組，見圖3D～E。

表2 CXCL5的表達與胃癌患者臨床特征的關(guān)系Table 2 Relation between CXCL5 expression and clinical characteristics of gastric cancer patients

3 討論

胃癌的病理學發(fā)生機制涉及多種基因與信號通路的改變，而其確切的發(fā)病機制尚未被完全闡明。因此，進一步研究胃癌的發(fā)病機制，尋找新的生物指標和治療靶點至關(guān)重要。CXCL5可通過其ELR功能區(qū)與CXCR2結(jié)合，進而介導腫瘤的生長、浸潤與轉(zhuǎn)移[15-16]。研究指出，CXCL5與非小細胞肺癌、膀胱癌、肝癌等的發(fā)病機制密切相關(guān)[16-18]。多項報道指出胃癌患者的血清CXCL5水平高于健康者[19]。而CXCL5在胃癌中的確切作用機制尚無報道。本研究結(jié)果顯示，胃癌患者血清與腫瘤組織中的CXCL5水平均出現(xiàn)顯著升高。同時，與對照組小鼠相比，過表達CXCL5組胃癌移植瘤小鼠的腫瘤體積顯著增高，生存期顯著降低。這些結(jié)果提示CXCL5可能參與胃癌的發(fā)生與發(fā)展機制。

圖1 胃癌患者血清(A)及腫瘤組織(B,C)中的CXCL5水平Figure 1 Expression of CXCL5 in serum(A) and tumor tissues(B,C) of gastric cancer patients

圖2 CXCL5過表達對胃癌細胞信號通路的影響Figure 2 Effect of CXCL5 overexpression on signal pathways of gastric cancer cells

胃癌腫瘤組織中NF-κB的表達水平顯著高于癌旁正常組織，且NF-κB的表達與胃癌的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]。Wnt/β-catenin信號通路作用廣泛，Wnt/β-catenin信號通路亦與胃癌密切相關(guān)[21]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，多種靶向Wnt/β-catenin信號通路的治療均能有效抑制胃癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移[21]。本研究中CXCL5過表達與重組CXCL5蛋白處理均能顯著增加SNU216與MFC細胞的p-NF-κB與p-β-catenin的表達水平，而不影響p-ERK、p-PI3K與p-AKT的表達水平，提示CXCL5可能通過NF-κB與Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮促胃癌的作用。

免疫治療利用腫瘤的免疫學特性殺滅腫瘤細胞和腫瘤組織[9-10]，現(xiàn)已成為腫瘤治療的熱點之一[8]。腫瘤的免疫治療通過調(diào)動宿主的免疫系統(tǒng)，使宿主對腫瘤的殺傷能力增強，進而消滅腫瘤細胞[8-9]。研究指出，與健康者相比，胃癌患者免疫細胞（如CD4+T細胞等）的數(shù)量均出現(xiàn)顯著降低[22]。本研究中，CXCL5過表達組胃癌移植瘤小鼠的腫瘤組織中CD4+T細胞、CD8+T細胞與CD56+CD16+NK細胞的數(shù)量均顯著低于對照組。因此，CXCL5可能通過NF-κB與Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮抑制胃癌腫瘤免疫的作用。

綜上所述，胃癌患者腫瘤組織及血清中CXCL5水平均顯著升高，CXCL5可能通過激活NF-κB與Wnt/β-catenin信號通路抑制胃癌的腫瘤免疫活性進而發(fā)揮促進胃癌的作用。

圖3 CXCL5過表達對胃癌移植瘤小鼠模型的影響Figure 3 Effect of CXCL5 overexpression on xenograft model of gastric cancer