郝 壯，高 倩，李德琰，金 娜，鄒聞書，李建東，陳長增，劉鳳華

（北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

植物提取物中的多種生物活性成分具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、抗菌等多種生理作用[1]，且植物提取物毒性小，副作用少，安全性高，引起廣泛關(guān)注與研究。有研究發(fā)現(xiàn)，植物提取物可顯著提高畜禽的平均日增重，降低耗料增重比，改善生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)[2]，還可改善腸道健康、降低腹瀉率和死亡率、增強免疫力、提高抗病能力[3]；還能緩解和預(yù)防運輸應(yīng)激，減少對動物的影響。

肌內(nèi)脂肪（IMF）對嫩度、風(fēng)味、多汁性的影響較大[4]，與消費者感官接受度呈正相關(guān)[5]，是人們評判肉品質(zhì)的一項重要指標。近年來，許多學(xué)者進行了脂代謝相關(guān)研究，鑒定出與脂代謝相關(guān)的多個基因。例如，PLIN5可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝和脂肪酸氧化，維持細胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[6]；脂肪組織中去飽和酶（SCD）[7]與脂肪酸含量有關(guān)[8]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，高通量測序已成為研究脂代謝的有效便捷的方法。

前期研究表明，枸芪提取物具有提高育肥豬生長性能的作用[9]。本試驗旨在研究在飼料中添加枸芪提取物改善育肥豬肉品質(zhì)的效果，利用RNA 測序技術(shù)鑒定影響脂質(zhì)代謝的相關(guān)基因和通路，為養(yǎng)殖生產(chǎn)及相關(guān)研究提供技術(shù)支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本試驗所用的枸芪多糖提取物為實驗室自制，枸杞、黃芪（1:2）共1 500 g，加10 倍量的水煎煮、干燥，加淀粉至900 g，粉碎，混勻經(jīng)過提取、濃縮至密度1.20～1.30 g/mL（50℃）、減壓干燥后制得，每克枸芪提取物中復(fù)合多糖含量為114.7 mg[10]。

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理 以胎次、日齡、體重和血緣相近的原則，選取80 日齡健康的大白×長白二元雜交豬180 頭，隨機分成2 組，每組6 個重復(fù)，每個重復(fù)15 頭，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組飼喂基礎(chǔ)日糧+200 mg/kg枸芪提取物，基礎(chǔ)日糧組成與營養(yǎng)成分見表1。試驗于2015 年7 月25 日—10 月28 日在北京市順義區(qū)北京匯川兆亮牧業(yè)有限公司進行，試驗期90 d。試驗期間，試驗豬自由采食、自由飲水。試驗開始和結(jié)束當天，結(jié)束飼喂并稱量空腹體重。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分

1.3 胴體性狀測定 試驗結(jié)束時，在對照組、試驗組各選3 頭屠宰。參照《豬性能測定規(guī)程》（DB43/T356-2007）進行測定并計算屠宰率、平均背膘厚、眼肌面積。

屠宰率=胴體重（kg）/宰前體重（kg）×100%

平均背膘厚（cm）=（皮下脂肪肩部最厚處+胸椎與腰椎結(jié)合處+腰椎與薦椎結(jié)合處）/3

眼肌面積（cm2）=（最后肋骨處背最長肌橫斷面）高度×寬度×0.7

1.4 肉品質(zhì)指標測定 試驗豬被宰殺45 min 內(nèi)，取胸腰椎連接部背最長肌新鮮橫切面，采用美制NPPC 肉色比色板（1991 版）和NPPC 大理石紋比色板（1991版），同步進行目測肉樣評分；試驗豬被宰殺后立即取背最長肌置于液氮罐中，用于高通量測序；使用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院研制的C-LM3 型數(shù)顯式肌肉嫩度儀，垂直于肌纖維方向測定肌肉嫩度；屠宰后2 h 內(nèi)，切取倒數(shù)第3～4 胸椎段背最長肌，采用懸吊法測定滴水損失；使用真空干燥箱進行水分測定；使用酸度計測定儀pH210 在肉樣上進行刺孔測定，豬被宰殺后45 min 內(nèi)，測定值記為pH45min，經(jīng)0～4℃成熟24 h 后，測定值記為pH24h；灰分依據(jù)《肉與肉制品 膽固醇含量測定》（GB/T 9695.24-2008）方法測定。

1.5 肌肉營養(yǎng)成分測定 屠宰后取背最長肌（不少于2 kg）冷凍送往農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心（北京）檢測粗蛋白質(zhì)、粗脂肪等營養(yǎng)成分。采用凱氏定氮法測定冷凍肉樣的粗蛋白質(zhì)含量。將凍干后的肉樣按索氏抽提法測定干樣的脂肪含量，即將肉樣進行無水乙醚浸泡過夜，65℃抽提6～8 h，回收烘至恒重稱重。維生素A 參照《肉與肉制品 維生素A 含量測定》（GB/T 9695.26-2008）方法測定；維生素E 參照《食品安全國家標準 食品中維生素A、D、E 的測定》（GB 5009.82-2008）方法測定；膽固醇參照《肉與肉制品 膽固醇含量測定》（GB/T 9695.24-2008）方法測定。參照《肉與肉制品 脂肪酸測定》（GB/T 9695.2-2008）測定13種脂肪酸含量。

1.6 RNA 測序 提取樣品總RNA 后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA 向得到的mRNA 中加入Fragmentation Buffer 使其片斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成cDNA 第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成cDNA 第二鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR 試劑盒純化并加EB 緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進行PCR 擴增，從而完成整個文庫制備工作，構(gòu)建好的文庫用Illumina HiSeq2500 進行測序，測序讀長為PE100。然后使用hisat2[11]比對豬參考基因組，通過基因組比對率來評估樣本的情況。

基因表達量使用FPKM 值法計算：

FPKM=cDNA Fragments/[Mapped Fragments（Millions）×Transcript Lentth（kb）]

式中，cDNA Fragments 表示比對到某一轉(zhuǎn)錄本上的片 段 數(shù) 目，即 雙 端Reads 數(shù) 目；Mapped Fragments（Millions）表示比對到轉(zhuǎn)錄本上的片段總數(shù)，以106個堿基為單位；Transcript Length （kb）：轉(zhuǎn)錄本長度，以103 個堿基為單位。

1.7 熒光定量PCR 檢測 使用Trizol（Sigma，Germany）提取背最長肌肉組織總RNA，然后根據(jù)制造商說明使用Primescript RT Master Kit（TaKaRa，中國大連）反向轉(zhuǎn)錄成互補DNA（cDNA）。差異基因（DEGs）引物由引物3 設(shè)計（http://primer3.ut.ee/）。熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）在AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（Vazyme，Nanjing，China）進行，反應(yīng)體積20 μL：Super Real Pre Mix Plus:10 μL（1×），上、下游引物各0.6 μL（0.3 μmol/L），cDNA 1 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL（1×）；ddH2O 7.4 μL。循環(huán)參數(shù)：95℃ 5 min，其次是40 個擴增循環(huán)，每個95℃ 10 s，然后60℃ 30 s。所有反應(yīng)均為每個樣品進行3 次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因為內(nèi)參基因，使基因的相對表達正?；??；虮磉_水平采用2－ΔΔCT值法計算。

1.8 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件進行單因子t 檢驗，試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸芪提取物對育肥豬胴體性狀的影響 由表2 可知，與對照組相比，試驗組豬的屠宰率升高5.68%（P＜0.05），背膘厚無顯著差異，眼肌面積增大4.1%（P＜0.05），提示飼料添加枸芪提取物對豬的胴體性狀產(chǎn)生了有利影響。

表2 枸芪提取物對育肥豬胴體性狀的影響

2.2 枸芪提取物對育肥豬豬肉理化特性的影響 由表3可知，與對照組相比，試驗組肌肉水分、pH 和粗蛋白質(zhì)含量差異均不顯著；肉色評分提高51.57%（P＜0.05），且在肉色正常范圍內(nèi)；大理石紋評分升高48.55%（P＜0.05），滴水損失下降37.55%（P＜0.05），剪切力降低20.60%（P＜0.05）。

由表4 可知，與對照組相比，試驗組肌肉粗脂肪含量降低21.43%（P＜0.05），膽固醇含量降低34.96%（P＜0.05），維生素A、維生素E 和粗灰分含量分別增加29.41%、71.89%和13.17%（P＜0.05）。

2.3 枸芪提取物對育肥豬豬肉脂肪酸含量的影響 由表5 可知，與對照組相比，試驗組肌肉亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸等必需脂肪酸（EFA）總含量升高2.77 倍（P＜0.01），豆蔻酸、棕櫚酸和十七碳酸等飽和脂肪酸（SFA）總含量下降17.74%，油酸和棕櫚油酸等不飽和脂肪酸（UFA）含量升高19.18%（P＜0.05），而且UFA 與SFA 比值上升。

表3 枸芪提取物對育肥豬肉理化特性的影響

表4 枸芪提取物對育肥豬豬肉營養(yǎng)成分的影響

表5 枸芪提取物對育肥豬豬肉中脂肪酸含量的影響

2.4 基因表達分析和差異基因鑒定 6 個背最長肌樣本間相關(guān)系數(shù)均不低于0.990，表明樣品之間表達模式的相似度非常高，組間肌肉轉(zhuǎn)錄組的絕大部分沒有發(fā)生變化（圖1-A）。

將轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果按照P＜0.05、|log2FC|＞1 的標準進行篩選，共得到256 個差異基因，其中有114 個上調(diào)、有142 個下調(diào)（圖1-B）。對差異基因進行功能注釋，篩選到102 個脂代謝相關(guān)基因（DEGs），將各組差異基因分組聚類分析（圖1-C），可以看到組內(nèi)樣品平行性良好，組間差異顯著。為了檢驗轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，隨機挑選10 個差異基因（DGAT2、APOE、ADIPOQ、ALDH3A2、PRKG1、PLIN5、SCD、ELOVL6、MOGAT1、AQP4）通過qRT-PCR 技術(shù)測定其表達量，分別比較10 個基因在轉(zhuǎn)錄組、qRT-PCR 實驗結(jié)果中的差異倍數(shù)，結(jié)果顯示，qRT-PCR 測得的基因表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組一致（圖2）。

2.5 差異基因GO 富集分析和KEGG 富集分析 GO 分析表明，篩選出的DEGs 與單不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸代謝、脂蛋白分解、脂肪酶活性等生物學(xué)功能有關(guān)。Pathway 通路分析結(jié)果顯示，它們主要參與甘油脂質(zhì)代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪細胞中脂多糖的調(diào)節(jié)等。

3 討 論

3.1 枸芪提取物對育肥豬胴體性狀的影響 屠宰率、背膘厚及眼肌面積是反映屠宰性能的重要指標，是衡量豬肉用性能的重要指標，與養(yǎng)豬生產(chǎn)的經(jīng)濟效益息息相關(guān)。Zhang 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、白芍、茯苓、合歡、使君子、枳實、柴胡等中草藥提取物可使豬胴體的眼肌面積顯著增加11.92%，平均背膘厚顯著下降29.34%；呂慧源等[13]在育肥豬日糧中添加黃芪、金銀花為主的中草藥添加劑，可明顯改善育肥豬的胴體性狀。本研究結(jié)果表明，在日糧中添加200 mg/kg 枸芪提取物組豬的屠宰率和眼肌面積較對照組分別提高5.68%和4.1%。由此可見，枸芪提取物可改善育肥豬的胴體性狀。

3.2 枸芪提取物對育肥豬肉理化性質(zhì)的影響 豬肉品質(zhì)的理化指標包括肉色、大理石紋、系水力、pH 和剪切力等；影響豬肉香味與嫩度的的主要因素是肌內(nèi)脂肪含量，且香味與嫩度、風(fēng)味物質(zhì)含量等指標高度相關(guān)；滴水損失和剪切力直接影響肉的口感和品質(zhì)[14]。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，試驗組肉色評分提高51.57%，大理石紋評分顯著提高48.55%，滴水損失降低37.55%，剪切力降低20.60%，水分與pH 無顯著變化，表明枸芪提取物可以提高肌間脂肪的沉積；有研究表明，膽固醇與心血管疾病息息相關(guān)[15]。人體中1/4 的膽固醇來自攝入的動物源食品，豬肉作為重要的肉食產(chǎn)品，低膽固醇豬肉逐漸成為熱門話題。維生素A 對細胞膜有著穩(wěn)定作用，維生素E 具有抗氧化功能，能保護細胞免受自由基的攻擊。李大光等[16]研究表明，在育肥豬日糧中添加枸杞子、五味子和松針粉等植物提取物，可以提高育肥豬的屠宰率與瘦肉率；試驗組背最長肌SFA比對照組顯著降低27.15%，而試驗組UFA 比對照組顯著提高了15.42%，從膽固醇的測定結(jié)果來看，試驗組比對照組顯著降低了9.1%。本研究結(jié)果顯示，添加枸芪提取物后膽固醇含量顯著降低34.96%，灰分、維生素A 和維生素E 含量都顯著增加，脂肪含量則顯著下降。

多不飽和脂肪酸（PUFA）作為人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，有促進細胞生長、調(diào)控基因表達、調(diào)節(jié)視力和腦發(fā)育等作用；PUFA 代謝生成的脂質(zhì)調(diào)控介質(zhì)對炎癥的啟動、發(fā)展以及消退均具有重要調(diào)節(jié)作用；PUFA 還是影響豬肉風(fēng)味的主要因素，其含量提高影響豬肉的風(fēng)味與品質(zhì)。本研究中，試驗組豬肉的亞油酸、亞麻酸含量分別是對照組的2.79、3.39 倍，顯著高于普通豬肉；EFA、SFA、UFA 和UFA/ SFA 的相對含量均有不同程度提高；黃紅衛(wèi)等[17]研究表明，隨著育肥豬日糧中枸杞渣添加量的增加，豬肉中亞油酸和花生酸、γ-亞麻酸等EFA 呈急劇提高的趨勢，對提高豬肉膳食保健功能具有潛在效果。本研究表明枸芪提取物對脂肪酸的組成和含量具有一定的調(diào)控作用。綜上所述，枸杞與黃芪不管是和其他中草藥配伍還是單獨作為飼料添加劑，對育肥豬生長性能、胴體性狀和肉品質(zhì)等方面均有不同程度的調(diào)控作用。

3.3 轉(zhuǎn)錄組水平上討論枸芪提取物對豬肉脂質(zhì)代謝的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，在256 個差異顯著的基因中有102 個差異基因與脂代謝相關(guān)，占總數(shù)差異基因的40%；GO富集分析結(jié)果顯示，脂肪酸代謝過程和脂肪酸轉(zhuǎn)運都與脂代謝相關(guān)；Pathway 分析發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸生物合成和甘油脂質(zhì)代謝等均參與脂肪酸的合成，用qRTPCR 技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)進行驗證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組相符。

SCD 是催化合成單不飽和脂肪酸的限速酶[18]，是影響豬的IMF 中脂肪酸構(gòu)成的重要因素，與IMF 呈正相關(guān)[19]，這與本研究結(jié)果相符。脂肪細胞C1Q 和膠原蛋白結(jié)構(gòu)（ADIPOQ）編碼生成脂聯(lián)素，間接影響肌肉脂肪酸氧化和葡萄糖攝取[20]，與脂肪沉積高度相關(guān)[19,21]，ADIPOQ 還與膽固醇和低密度脂蛋白的濃度有關(guān)。載脂蛋白E（APOE）在膽固醇等脂類轉(zhuǎn)運和代謝過程中發(fā)揮重要作用[22]，其通過多個途徑影響人的膽固醇代謝、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、葡萄糖代謝等功能，敲除APOE基因后血液中膽固醇含量升高[23]。但本試驗發(fā)現(xiàn)，APOE 與豬背最長肌的脂代謝密切相關(guān)，膽固醇含量顯著下降可能與APOE 有關(guān)。二?；视王；D(zhuǎn)移酶2（DGAT2）是甘油三酯（TG）合成的限速酶，與畜禽脂肪沉積、背膘厚有關(guān)[24]，在脂質(zhì)代謝中扮演著重要的角色。本研究數(shù)據(jù)顯示，DGAT2 上調(diào)、粗脂肪含量下降，這可能是由于游離脂肪酸增多導(dǎo)致。此外，本研究首次發(fā)現(xiàn)PPKG1基因可能與脂質(zhì)代謝相關(guān)。

綜上所述，枸芪提取物在轉(zhuǎn)錄組水平上干預(yù)某些脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因，從而提高豬肉不飽和脂肪酸含量，提高豬肉品質(zhì)；從分子水平上提供一種更好理解枸芪植物提取物改善豬肉品質(zhì)的信息，為下一步研究指引了方向。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，枸芪提取物可改善育肥豬胴體性狀、豬肉理化性質(zhì)；在轉(zhuǎn)錄組水平上干預(yù)某些脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因，提高豬肉中不飽和脂肪酸和人體必需脂肪酸含量，顯著改善豬肉品質(zhì)。