皮小雪，蔡曉琳，李夢彤，黃 錚，陳 裕，樊翌明，施 歌,2* （.廣東醫(yī)科大學(xué)皮膚性病學(xué)教研室，廣東湛江 52400；2.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院醫(yī)學(xué)美容整形中心，廣東廣州 50000）

嬰兒血管瘤(IH)是嬰兒常見的良性腫瘤，在新生兒和早產(chǎn)兒中的發(fā)病率分別為2.6%～4.5%、23%。多數(shù)IH在兒童早期自然消退，但出現(xiàn)并發(fā)癥及特殊部位IH應(yīng)盡早治療[1]。中國和歐洲指南推薦口服普萘洛爾(PRO)為IH一線治療[2-3]。局部應(yīng)用噻嗎洛爾(TIM)也已顯示出治療淺表和部分深層血管瘤的功效和安全性[4]，但其外用存在較多缺點，如藥物滲透能力不佳、劑量難以控制、外敷紗布易脫落等。普萘洛爾系統(tǒng)性使用時不良反應(yīng)明顯，包括低血糖、低血壓、心動過緩、腹瀉、睡眠障礙、氣道高反應(yīng)性等[5]。因此，研制出新型藥物制劑對IH治療具有重要意義。鑒于納米金可作為抗腫瘤藥物載體，在抗血管新生效應(yīng)中具有協(xié)同作用[6-7]。本文觀察了PRO、TIM納米金絡(luò)合物對人血管瘤內(nèi)皮細胞(HemECs)增殖、凋亡及細胞周期的影響，旨在探討其對血管瘤的潛在作用機制。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

HemECs(ATCC細胞庫，北京北納創(chuàng)聯(lián)公司)；PRO、TIM(美國Sigma公司)；納米金(GNR)及PRO、TIM納米金絡(luò)合物(廣州珂納偲公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清(美國Gibco公司)；CellTiter 96 Cell Proliferation Assay試劑盒(美國Promega公司)；細胞周期和細胞凋亡測定試劑盒(上海Yeasen公司)；Annexin V/PI 雙染試劑盒(美國Pharmingen 公司)；Mutiskan GO全波長酶標儀(美國Thermo公司)；FACSCanto II流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

HemECs用含10%(體積分數(shù))胎牛血清DMEM培養(yǎng)基置于37 °C、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，預(yù)處理后倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3 計算24 h半數(shù)抑制濃度(IC50)

4.0×103/孔HemSCs接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)液，每孔分別加入不同質(zhì)量濃度 PRO(0、2、4、8、16、32、64、128 mg/L)、TIM(0、60、120、240、480、960、1 920、3 840 mg/L)、GNR(0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 OD) 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每個質(zhì)量濃度設(shè)4個復(fù)孔。加入MTS溶液(5 g/L)100 μL，37 °C、5% CO2孵育2 h，吸出上清液，酶標儀在490 nm波長處測定吸光度值，運用GraphPad Prism 7.0軟件計算IC50。

1.4 MTS法檢測細胞增殖率

4.0×103/孔HemSCs接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)液，分為空白對照組(CTL組)、 PRO組、TIM組、GNR組、PRO+GNR(P+G)組、TIM+GNR(T+G)組，按IC50分別加入PRO、TIM、GNR、P+G、T+G，繼續(xù)培養(yǎng)0、1、3、6、12、24、36、48 h，每組設(shè)4個復(fù)孔。按1.3中所述，檢測每組細胞不同時間點增值率，繪制細胞生長曲線。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡

0.3×106/孔HemSCs接種到6孔板，按1.4中實驗組別設(shè)置、處理，胰酶消化、收集細胞，70%乙醇中固定過夜，加入RNase A溶液37 ℃處理30 min，400 μL碘化丙啶溶液4 ℃避光染色20 min。FACSC-anto II流式細胞儀分析染色細胞，F(xiàn)low Jo 7.6 軟件鑒定細胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS23.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 7.0進行作圖分析。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差，方差齊采用單因素方差分析及LSD進行檢驗，不齊則用Welch近似方差分析及Dunnett’s T3進行檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PRO、TIM、GNR對HemECs的IC50

PRO、TIM、GNR對 HemECs的 IC50分 別 為25.46、1 081 mg/L、0.06559 OD(圖1)。

2.2 HemECs形態(tài)學(xué)觀察

以IC50 PRO、TIM、GNR處理HemECs 24 h，倒置顯微鏡發(fā)現(xiàn)CTL組細胞呈長梭形、紡錘狀，貼壁狀態(tài)良好；加藥組細胞近似圓形、橢圓狀，較多漂浮細胞，且細胞體積較對照組明顯變小，細胞團生長受抑(圖2)。

2.3 PRO、TIM、GNR及其絡(luò)合物對HemECs 增殖影響

圖1 PRO、TIM、GNR對HemECs細胞量效曲線圖

以IC50 藥物處理HemECs 1 h，MTS顯示PRO、TIM、GNR、P+G和T+G組與CTL組細胞增值率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在處理3、6 h，與CTL組比較，P+G和T+G組細胞增殖率下降(P<0.01)，PRO、TIM、GNR組增值率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在處理12、36 、48 h，加藥組細胞增殖率均低于CTL組(P<0.001或0.05)，其中P+G、T+G組更顯著(P<0.001或0.01)；PRO與TIM、P+G與T+G組間細胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

圖3 PRO、TIM、GNR及其絡(luò)合物對HemECs增殖影響

2.4 普萘洛爾、噻嗎洛爾、納米金及其絡(luò)合物對HemECs細胞周期影響

以IC50藥物處理HemECs 24 h，加藥組與空白對照組相比，G1、S、G2期細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

2.5 PRO、TIM、GNR及其絡(luò)合物及其絡(luò)合物對HemECs凋亡影響

以IC50藥物處理HemECs 24 h，PRO組、TIM組、GNR組、P+G組與T+G組細胞凋亡率高于CTL組(P<0.001或0.01)，其中P+R、T+R組更顯著(P<0.001)；PRO與TIM、P+G與T+G組間細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖5)。

圖4 PRO、TIM、GNR及其絡(luò)合物對HemECs細胞周期影響

3 討論

我們通過MTS檢測顯示普萘洛爾、噻嗎洛爾及納米金處理HemECs 24 h 后IC50分別為25.46、1081 mg/L、0.06559 OD。Bota等[8]采用MTT法研究普萘洛爾處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞( HUVECs)24 h后，其IC50為81.94 mg/L。Li等[9]采用MTT實驗顯示普萘洛爾處理血管瘤源性干細胞(HemSCs)6 h后 IC50為189.4 μmol/L。我們推測其差異可能是由于細胞株、處理細胞時間或試劑盒不同引起。此外，普萘洛爾、噻嗎洛爾、納米金及與絡(luò)合物均使HemECs形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形，這與Li等[9]通過高濃度(100～400 μmol/L)普萘洛爾處理HemSCs后細胞形態(tài)變化結(jié)果是相一致的。這些進步一提示，普萘洛爾、噻嗎洛爾、納米金及其絡(luò)合物對HemECs生長具有抑制作用。

圖5 PRO、TIM、GNR及其絡(luò)合物對HemECs凋亡影響

Huang等[10]研究表明普萘洛爾通過上調(diào)miR-125b表達抑制HemECs的增殖和促進細胞凋亡。Sun等[11]發(fā)現(xiàn)普萘洛爾可能通過抑制DLL4/Notch1/Akt通路抑制HemECs增殖和侵襲。大量研究報道局部使用噻嗎洛爾抑制IH生長并促進其消退[12-13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)普萘洛爾、噻嗎洛爾抑制HemECs的增殖。為進一步了解普萘洛爾和噻嗎洛爾抑制HemECs增殖的可能機制，我們用流式細胞術(shù)觀察普萘洛爾、噻嗎洛爾作用后HemECs細胞周期及凋亡變化，發(fā)現(xiàn)用藥組凋亡細胞比例較對照組顯著增加，而細胞周期比例的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Sipkova等[14]用噻嗎洛爾外敷治療IH，1周后組織病理及透射電鏡檢查顯示IH血管內(nèi)皮細胞凋亡、血管阻塞。同樣，普萘洛爾治療的IH標本中也出現(xiàn)細胞凋亡[15]。普萘洛爾通過抑制細胞周期蛋白D1、CDK-4、CDK-6和磷酸化Rb表達，調(diào)控G0/G1期HemECs細胞周期停滯，進而抑制細胞增殖進展[16]。此外，多項研究表明普萘洛爾促進HemECs細胞凋亡，其機制可能通過激活內(nèi)外源性凋亡通路(激活caspase-9、caspase-3，上調(diào)p53水平，增加Bax/Bcl-xL比值)[17-18]，抑制VEGF-A/VEGFR-2自分泌環(huán)介導(dǎo)的抗凋亡作用[19]。因此，我們推測普萘洛爾和噻嗎洛爾均抑制HemECs增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡，其具體機制有待進一步研究。

納米金常作為藥物載體，與抗腫瘤藥物具有靶向協(xié)同作用，可提高抗血管新生效果[20]。核酸納米金傳感器可以無創(chuàng)監(jiān)測細胞血管生成生物標志物Lrg1在血管生成中的表達[21]。納米金聯(lián)合光熱療法具有靶向抗腫瘤和抗血管生成的作用[22]。在本研究中，納米金可抑制HemECs細胞增殖，促進凋亡，但對其細胞周期無影響。納米金可與肝素特異性結(jié)合，阻斷生長因子(如 bFGF、VEGF)與內(nèi)皮細胞受體結(jié)合，進而抑制血管的生成和腫瘤生長[23]。 Song 等[24]研究表明聚乙二醇化的納米金(PEG-GNR)可抑制血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管生成。此外，我們發(fā)現(xiàn)普萘洛爾或噻嗎洛爾納米金絡(luò)合物對HemECs增殖和凋亡的作用優(yōu)于單用普萘洛爾、噻嗎洛爾。鑒于納米金可作為抗腫瘤藥物載體，我們推測納米金可與普萘洛爾或噻嗎洛爾發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，增強普萘洛爾或噻嗎洛爾對血管瘤細胞的抑制作用。這些結(jié)果還需要納米金生物相容性、體內(nèi)實驗、動物模型等進一步驗證。

綜上所述，我們的結(jié)果提示普萘洛爾、噻嗎洛爾、納米金可能通過促進細胞凋亡抑制HemECs增殖，納米金可與普萘洛爾或噻嗎洛爾發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，但具體機制有待進一步研究。