唐 靜 許娟娟 袁秀芝

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院藥劑科，武漢 430077

我國是糖尿病大國，預(yù)計(jì)到2030年中國的糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到1.40億[1]。糖尿病的發(fā)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，機(jī)體一旦出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，微循環(huán)會(huì)受到破壞，繼而累及血管內(nèi)皮細(xì)胞。黃芪是常用中藥，研究[2]表明其能改善氧化應(yīng)激，從而改善糖尿病帶來的不利影響。本實(shí)驗(yàn)通過在高糖環(huán)境中培養(yǎng)人臍靜脈系內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，比較了不同濃度黃芪總黃酮提取物對高糖損傷HUVECs細(xì)胞的保護(hù)作用，并檢測了影響血管內(nèi)環(huán)境的NO、T-SOD、ET-1的含量，為黃芪總黃酮的降糖研究提供了進(jìn)一步的證據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

HUVECs購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

黃芪總黃酮提取物(自提)，葡萄糖(南京建成生物工程研究所)，甘露醇(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)，總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所)，一氧化氮(nitric oxide，NO)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Trizol試劑(Aidlab公司)，DL2000 DNA Marker(TAKARA公司)。DMEM培養(yǎng)基(低糖型)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.3 主要儀器

R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BuChi公司)，EDC-810型PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)，Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo scientific)，C2500-R-230V微型高速離心機(jī)。

1.4 細(xì)胞處理

采用隨機(jī)數(shù)字表法將HUVECs細(xì)胞分為：①正常對照組，加入5.5 mmol/L葡萄糖；②高糖模型組，加入30 mmo1/L葡萄糖；③高滲對照組，先加入24.5 mmol/L甘露醇，2 h后加入5.5 mmol/L葡萄糖；④黃芪總黃酮高劑量組，先加入2 mg/mL黃芪總黃酮，2 h后加入30 mmol/L葡萄糖；⑤黃芪總黃酮中劑量組，先加入1 mg/mL黃芪總黃酮，2 h后加入30 mmol/L葡萄糖；⑥黃芪總黃酮低劑量組，先加入0.5 mg/mL黃芪總黃酮，2 h后加入30 mmol/L葡萄糖。以上5組細(xì)胞處理完畢后置于CO2培養(yǎng)箱中37℃，5% CO2培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 NO、T-SOD水平 各組細(xì)胞均在高糖處理前分別加入藥物，培養(yǎng)24 h后取細(xì)胞上清液，按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，檢測各組細(xì)胞NO、T-SOD水平。

1.5.2 病理變化 將各組細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定爬片，常規(guī)HE染色，在200倍顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5.3 RT-PCR檢測ET-1 mRNA水平 通過Trizol法提取RNA后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，測定HUVECs細(xì)胞內(nèi)ET-1 mRNA的表達(dá)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法比較分析各組ET-1 mRNA表達(dá)[3]。引物序列見表1。

1.5.4 Western blot法檢測ET-1蛋白表達(dá) 倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液，加入4℃預(yù)冷的PBS液洗滌細(xì)胞后加入裂解液，充分裂解后，12 000 rpm離心5 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，-20℃凍存?zhèn)溆谩?0%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，用1×TBS漂洗一次，加入含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h，分別加入一抗，4℃過夜，洗膜后分別加入HRP標(biāo)記二抗，37℃搖床孵育2 h，用TBST充分洗滌PVDF膜；加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)后置于曝光機(jī)上曝光，用BandScan軟件分析膠片灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算相對表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃芪總黃酮對高糖損傷HUVECs NO、T-SOD水平的影響

培養(yǎng)24 h后，與正常對照組比較，高糖模型組NO、T-SOD水平明顯降低(P<0.05)。與高糖模型組比較，黃芪總黃酮高、中、低劑量組NO、T-SOD水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞NO、T-SOD水平比較

與正常對照組比較，*P<0.05；與高糖模型組比較，△P<0.05

2.2 黃芪總黃酮對高糖損傷HUVECs形態(tài)的影響

HE染色顯示，正常對照組、高滲對照組HUVECs大小均勻；高糖模型組視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少，大小分布不均；黃芪總黃酮高、中、低濃度干預(yù)后，細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)了明顯的增加，形態(tài)較高糖模型組略為規(guī)整；且隨著黃芪總黃酮濃度的變化，細(xì)胞數(shù)量也呈現(xiàn)出不同的變化，黃芪總黃酮高劑量組的細(xì)胞數(shù)量增加最為顯著。見圖1。

2.3 黃芪總黃酮對高糖損傷HUVECs ET-1 mRNA水平的影響

不同組別擴(kuò)增出來的內(nèi)參GAPDH表達(dá)一致，說明整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系正常，見圖2。與正常對照組比較，高糖模型組的ET-1 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與高糖模型組比較，黃芪總黃酮高、中、低劑量組ET-1 mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05)，且黃芪總黃酮高劑量降低最為顯著(P<0.05)。見圖3及圖4。

1為正常對照組；2為高糖模型組；3為高滲對照組；4為黃芪總黃酮高劑量組；5為黃芪總黃酮中劑量組；6為黃芪總黃酮低劑量組

1為DL2000；2為正常對照組；3為高糖模型組；4為高滲對照組；5為黃芪總黃酮高劑量組；6為黃芪總黃酮中劑量組；7為黃芪總黃酮低劑量組

1為DL2000；2為正常對照組；3為高糖模型組；4為高滲對照組；5為黃芪總黃酮高劑量組；6為黃芪總黃酮中劑量組；7為黃芪總黃酮低劑量組

1為正常對照組；2為高糖模型組；3為高滲對照組；4為黃芪總黃酮高劑量組；5為黃芪總黃酮中劑量組；6為黃芪總黃酮低劑量組

2.4 黃芪總黃酮對高糖損傷HUVECs ET-1蛋白表達(dá)的影響

不同組別內(nèi)參GAPDH表達(dá)一致，說明整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系正常，見圖5。與正常對照組比較，高糖模型組的ET-1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與高糖模型組比較，黃芪總黃酮高、中、低劑量組ET-1蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，且黃芪總黃酮高劑量降低最為顯著(P<0.05)。見圖6及圖7。

1為正常對照組；2為高糖模型組；3為高滲對照組；4為黃芪總黃酮高劑量組；5為黃芪總黃酮中劑量組；6為黃芪總黃酮低劑量組

1為正常對照組；2為高糖模型組；3為高滲對照組；4為黃芪總黃酮高劑量組；5為黃芪總黃酮中劑量組；6為黃芪總黃酮低劑量組

1為正常對照組；2為高糖模型組；3為高滲對照組；4為黃芪總黃酮高劑量組；5為黃芪總黃酮中劑量組；6為黃芪總黃酮低劑量組

3 討論

HUVECs在循環(huán)血液和血管壁之間起到天然屏障作用，對神經(jīng)、體液，特別是血流動(dòng)力學(xué)變化作出反應(yīng)。高糖毒性會(huì)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成增多，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)；應(yīng)激產(chǎn)生的多種炎性因子，會(huì)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。黃芪作為經(jīng)典的中藥，其主要成分黃芪皂苷[4-5]、黃芪多糖[6-7]和黃芪總黃酮均有降糖療效，目前對黃芪皂苷和黃芪多糖的高糖損傷保護(hù)作用的探討較多，本研究主要從從細(xì)胞學(xué)的角度，研究了黃芪總黃酮可抑制氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而保護(hù)了HUVECs免受高糖損傷。

HE染色可以直觀清晰地反映細(xì)胞結(jié)構(gòu)，染色后的細(xì)胞漿呈粉紅色，通過不同劑量黃芪總黃酮干預(yù)后，在光學(xué)顯微鏡下，能直接觀察各組細(xì)胞的數(shù)量變化。血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋于血管內(nèi)膜表面直接與循環(huán)血液接觸，很容易受到血液中活性物質(zhì)的影響，NO和ET-1分別為重要的血管舒張因子及收縮因子，在維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性方面起著重要作用[8-9]。T-SOD是一種重要的內(nèi)源性活性物質(zhì)，可消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，高糖模型組細(xì)胞NO、T-SOD水平明顯降低，細(xì)胞數(shù)量減少，ET-1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高，說明高糖對HUVECs會(huì)造成明顯損傷；與高糖模型組比較，黃芪總黃酮高、中、低劑量組NO、T-SOD水平明顯升高，細(xì)胞數(shù)量增加，ET-1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低，說明黃芪總黃酮能對高糖損傷HUVECs產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制很可能是通過抑制HUVECs中ET-1的分泌而實(shí)現(xiàn)的；且高、中、低劑量黃芪總黃酮對HUVECs的保護(hù)作用，存在一定的劑量相關(guān)性，劑量越大則對HUVECs的保護(hù)作用越顯著。改善高糖引起的血管內(nèi)皮功能紊亂的機(jī)制較為復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)通過ET-1途徑來研究高糖損傷HUVECs略顯單薄，下一步可對其保護(hù)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

綜上所述，不同濃度黃芪總黃酮對高糖損傷的HUVECs細(xì)胞均有保護(hù)作用，可促進(jìn)NO、T-SOD分泌，提升細(xì)胞數(shù)量，抑制ET-1 mRNA及蛋白表達(dá)，且高濃度黃芪總黃酮的保護(hù)效果最為顯著。