李淑玲 郭明洲 仉子軒 李 聞

(中國人民解放軍總醫(yī)院，解放軍醫(yī)學院，北京 100853)

GW4064是一種已知的膽汁酸核法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)的小分子激動劑,FXR受體參與機體的代謝及炎癥的調(diào)節(jié)。FXR不僅在肝臟、腸道和腎臟中表達，在免疫細胞中也同樣發(fā)現(xiàn)了FXR的表達[1-3]。最新研究發(fā)現(xiàn)FXR可抑制NLRP3的激活從而調(diào)節(jié)NLRP3相關的炎癥反應[4]。GW4064通過激活FXR可下調(diào)肝臟NF-κB信號的激活，進一步調(diào)控肝臟炎癥的發(fā)生發(fā)展[5]。雖然目前有大量的研究顯示FXR基因具有抗炎作用，但是對于FXR激動劑GW4064對LPS導致炎癥反應的作用及機制有待深入研究；而巨噬細胞是參與炎癥反應的主要免疫細胞，巨噬細胞在激活后可產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁的一個組成部分，可激活巨噬細胞釋放炎癥介質(zhì)，包括一氧化氮(NO)、炎癥細胞因子(如IL-1β、TNF-α等)；而NO主要受活化巨噬細胞在炎癥狀態(tài)下iNOS過表達的影響而產(chǎn)生[6]。 因此，本研究主要探討LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞模型中GW4064對促炎因子的分泌和釋放，iNOS表達和NO產(chǎn)生的影響，為GW4064在免疫細胞中的抗炎作用提供進一步的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞株購自北京協(xié)和細胞庫；GW4064購自Selleck公司；胎牛血清(FBS，10099141)購自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基和雙抗(青霉素+鏈霉素)購自Hyclone公司；二甲基亞砜(DMSO)購自Amresco公司；內(nèi)毒素(LPS)購自Sigma公司；iNOS抗體、NF-κB抗體、β-actin抗體購自Abcam公司；p-NF-κB抗體購自CST公司；HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)、HRP標記山羊抗小鼠IgG(H+L)購自碧云天生物技術有限公司；引物購自華大基因研究中心；逆轉錄試劑盒購自Invitrogen公司;SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自ToYoBo公司；AimPlex流式高通量多因子購自曠博生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及GW4064溶解 RAW264.7細胞用含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。用DMSO配成不同終濃度的GW4064溶液用于實驗。

1.2.2促炎細胞因子的測定 將RAW264.7細胞按照5×105個/孔接種于6孔板中，分為對照組、LPS組、2 μmol/L GW4064+LPS組、4 μmol/L GW4064+LPS組、8 μmol/L GW4064+LPS組、16 μmol/L GW4064+LPS組。每組設置3個復孔。除對照組外，其余每孔用GW4064(0、2、4、8、16 μmol/L)預處理24 h,然后加入 1 μg/ml的LPS培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后，取細胞上清于熱滅活的EP管中，4 000 r/min離心10 min后，收集細胞上清存于-80℃冰箱中，用于細胞因子的檢測。用TRIzol提取RNA，定量后逆轉錄成cDNA。采用SYBR Green PCR試劑進行PCR產(chǎn)物的擴增和檢測，以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算各因子的mRNA的相對表達量。

1.2.3細胞上清中NO的測定 將RAW264.7細胞按照5×105個/孔接種于48孔板中，分為對照組、LPS組、1 μmol/L GW4064+LPS組、10 μmol/L GW4064+LPS組、20 μmol/L GW4064+LPS組,每組設5個復孔。除對照組外，其余每組加入終濃度為0、1、10、20 μmol/L的GW4064預處理24 h,然后加入 1 μg/ml的LPS于細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。收集細胞上清，按照Griess試劑盒的操作步驟檢測細胞上清中NO的量。

1.2.3細胞中iNOS和NF-κB蛋白的表達 采用Western blot技術檢測iNOS和NF-κB蛋白的表達：將RAW264.7細胞按照5×105個/孔接種于6孔板中，設置2個復孔，LPS單獨或與不同濃度的GW4064處理后，收集蛋白。用預冷的PBS清洗2遍，每孔加入300 μl含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃13 000 r/min 離心30 min，收集上清，按照BCA定量試劑盒的說明測定收集的蛋白濃度。用SDS-PAGE凝膠分離蛋白，然后轉移至PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶在室溫下對PVDF膜封閉 1 h,4℃過夜，分別孵育iNOS(1∶250)抗體，NF-κB(1∶1 000)抗體，p-NF-κB(1∶1 000)抗體，β-actin(1∶2 000)抗體。PBST洗膜3次，每次10 min,在室溫下孵育相對應的二抗1 h,PBST洗膜3次，每次10 min，然后進行曝光。使用Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結果

2.1GW4064對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子TNF-α、MCP-1分泌及IL-1β、TNF-α、iNOS基因表達的影響 與正常對照組相比，RAW264.7細胞受LPS刺激后，促炎因子IL-1β、TNF-α、iNOS的基因的表達顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，給予GW4064(2、4、8、16 μmol/L)預處理后，IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA的表達均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。同樣，與正常組相比，LPS誘導的炎癥模型組中，細胞上清中TNF-α、MCP-1因子的分泌顯著上升，而給予GW4064處理后，可呈劑量依賴性地降低TNF-α、MCP-1的分泌，差異具有統(tǒng)計學意義，見圖2。

2.2GW4064對LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放的影響 與對照組相比，模型組RAW264.7細胞受LPS刺激后釋放大量NO，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);用不同濃度GW4064預處理RAW264.7細胞釋放NO的量均有不同程度降低，并呈劑量依賴性降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； 實驗表明，GW4064可抑制巨噬細胞中NO的釋放。見圖3。

圖1 GW4064對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子mRNA表達的影響Fig.1 Effects of GW4064 on mRNA expression of inflamm-atory factors in LPS-stimulated RAW264.7Note:Compared with LPS group，*.P<0.05，#.P<0.01.

圖2 GW4064對LPS誘導的RAW264.7細胞上清中炎癥因子TNF-α、MCP-1分泌的影響Fig.2 Effects of GW4064 on cell supernatant secretion of TNF-α,MCP-1 in LPS-stimulated RAW264.7Note:*.P<0.05，**.P<0.01.

圖3 GW4064對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放NO的影響Fig.3 Effects of GW4064 on production of NO in LPS-stimulated RAW264.7Note:*.P<0.05,**.P<0.01.

2.3GW4064對LPS誘導的RAW264.7細胞iNOS及NF-κB蛋白表達的影響 Western blot 顯示，GW4064 (10、20 μmol/L)可顯著抑制LPS誘導的巨噬細胞iNOS的蛋白的表達(P<0.01)，雖然1 μmol/L 的GW4064降低了iNOS蛋白的表達，但是差異無統(tǒng)計學意義(P=0.062)，如圖4所示。NF-κB磷酸化程度可以反映巨噬細胞中NF-κB激活的程度，通過Western blot對NF-κB磷酸化蛋白及總蛋白進行檢測，結果顯示不同濃度的GW4064均能抑制LPS誘導的巨噬細胞中NF-κB的磷酸化，如圖5所示。

圖4 GW4064對LPS誘導的RAW264.7細胞iNOS蛋白表達的影響Fig.4 Effects of GW4064 on expression of iNOS protein in LPS-stimulated RAW264.7Note:**.P<0.01.

圖5 GW4064對LPS誘導的RAW264.7細胞p-NF-κB蛋白表達的影響Fig.5 Effects of GW4064 on expression of p-NF-κB protein in LPS-stimulated RAW264.7Note:**.P<0.01.

3 討論

核受體是配體調(diào)節(jié)因子家族，其在代謝和免疫功能之間發(fā)揮穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)功能。膽汁酸核受體FXR是在免疫細胞如巨噬細胞中表達的膽汁酸傳感器，F(xiàn)XR缺陷小鼠可出現(xiàn)免疫反應的失調(diào)。研究顯示在巨噬細胞中，膽汁酸受體FXR和干擾素γ-STAT-1通路存在相互調(diào)節(jié)，參與炎癥反應的調(diào)控[2]。一些研究表明，炎癥因子LPS、TNF-α和IL-1β對FXR也發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用，在炎癥急性期，組織中FXR基因表達下調(diào)[7]。盡管FXR具有潛在的抗炎特性，但是對于FXR及激動劑GW4064在巨噬細胞中對炎癥因子的調(diào)節(jié)及對NO、iNOS是否具有調(diào)節(jié)作用尚不明確。盡管炎癥是免疫系統(tǒng)保持完整性和抵抗生理學威脅的基本防御機制，但是炎癥的紊亂可導致各種疾病的發(fā)生發(fā)展，包括各種急性炎癥和慢性炎癥。本研究顯示，GW4064可抑制LPS活化的巨噬細胞炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α mRNA的表達，同時抑制細胞上清中炎癥因子TNF-α、MCP-1分泌。而炎癥因子作為早期炎癥的標志物，在機體損傷、感染等情況大量分泌，促進炎癥反應的發(fā)生，可進一步加重機體各組織的損傷。

NO作為細胞間信息傳遞的重要分子，可直接抑制細菌物種的生長，這種氣體增加了由活化的中性粒細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的H2O2的殺菌活性，參與機體的炎癥和免疫反應[8]； LPS誘導的巨噬細胞可產(chǎn)生過量的NO導致細胞及組織的損傷，本研究顯示GW4064可呈劑量依賴性的抑制受LPS激活的RAW264.7巨噬細胞中NO的產(chǎn)生?？梢?，GW4064可在一定程度上通過減少NO的釋放，進而發(fā)揮其抗炎作用，而NO的過量產(chǎn)生主要是由iNOS的異常表達引起，iNOS的過度或異常表達與許多疾病過程的發(fā)病機理有關[9]。因此，抑制iNOS的表達有助于控制由iNOS導致的相關炎癥性疾病[10]。NF-κB作為一種轉錄因子，與機體的炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)等密切相關[11,12]，炎癥因子和iNOS的表達需要NF-κB的參與，而磷酸化是NF-κB基于激活的關鍵步驟。本研究發(fā)現(xiàn)，GW4064干預后，受LPS激活的巨噬細胞中的iNOS的mRNA及蛋白的表達呈劑量依賴性的下降，抑制了NO的生成，并且GW4064負調(diào)控LPS誘導的RAW264.7細胞中NF-κB磷酸化，這可能是減輕巨噬細胞炎癥反應的主要原因和機制之一。

總之，GW4064具有潛在的抑制巨噬細胞炎癥反應的作用，可以抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并負調(diào)控由LPS誘導的巨噬細胞iNOS和NF-κB的表達，這可能是FXR調(diào)控炎癥反應的機制之一，有助于揭示GW4064在調(diào)控炎癥性疾病中的潛在應用價值。