尤 楊 夏 岳 戚國(guó)慶 高宏陽(yáng) 楊志瑜 李 柳 趙紅亮

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)三科，石家莊 050031)

高尿酸血癥是一種慢性代謝性疾病，主要由機(jī)體尿酸排泄障礙和嘌呤代謝紊亂引起，與胰島素抵抗、高脂血、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病聯(lián)系密切，威脅人類(lèi)健康[1-4]。隨著血清尿酸(uric acid,UA)升高，抗氧化能力降低，機(jī)體清除自由基的能力受到抑制。臨床研究表明，高尿酸血癥患者血清脂質(zhì)過(guò)氧化物水平升高，抗氧化酶活力下降，炎癥因子水平升高[5]。目前臨床治療高尿酸血癥的藥物主要為非甾體抗炎藥、促尿酸排泄藥、抑制尿酸生成藥，常伴有胃腸道反應(yīng)和肝腎損害，療效并不理想[6]。他汀類(lèi)藥物是臨床應(yīng)用最廣泛的調(diào)脂藥，抗炎、抗氧化等作用，調(diào)脂作用強(qiáng)、耐受性好。匹伐他汀是第三代他汀類(lèi)藥物，目前尚未發(fā)現(xiàn)匹伐他汀對(duì)高尿酸血癥影響的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察匹伐他汀對(duì)高尿酸血癥大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子水平的影響，探討其作用機(jī)制，為臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量(240±20)g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SYXK(冀)2018-0008，22～25℃、濕度(55±5)%，光照2 h飼養(yǎng)。

1.1.2試劑 HE染色試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)；PAS染色試劑盒和Masson染色試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)；兔抗鼠TGF-β1抗體(武漢博士德生物制品公司)；SOD、T-AOC、MDA、CAT和GSH-Px試劑盒(南京建成生物工程研究所)；IL-6、TNF-α和TGF-β1 ELISA試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥 36只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組12只，根據(jù)文獻(xiàn)[7]，模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃給予酵母膏(10 g/kg)、腺嘌呤(100 mg/kg)，連續(xù)14 d，建立高尿酸血癥大鼠模型。實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃給予匹伐他汀0.3 mg/kg，對(duì)照組與模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥4周。每天觀察并記錄大鼠體型、毛色和精神狀態(tài)。

1.2.2HE、PAS和Masson染色 取大鼠左側(cè)腎臟組織，生理鹽水沖洗，置于4%甲醛溶液，固定12 h，常規(guī)石蠟包埋，切片(5 μm)、脫蠟、水化，HE染色、PAS染色和Masson染色，光鏡下觀察腎臟組織的病理變化情況，Masson染色后膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色 取石蠟切片，常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化，1.8%甲醇H2O2混合液滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波熱修復(fù)抗原，加入兔抗鼠TGF-β1抗體(1∶100)；對(duì)照組采用Tris代替一抗，4℃孵育12 h，Tris緩沖液清洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，DAB染色，蘇木素復(fù)染。

1.2.4指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后禁食不禁水125 min，3 000 r/min離心10 min，分離血清，比色法測(cè)定大鼠血清MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD、T-AOC、GSH-Px、CAT活性，操作按照說(shuō)明書(shū)指示進(jìn)行。酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)血清IL-6、TNF-α和TGF-β1水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1一般情況 各組大鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未死亡，對(duì)照組大鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)，毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)良好。模型組大鼠隨造模時(shí)間增加，出現(xiàn)體質(zhì)量下降、毛發(fā)干枯無(wú)光澤、精神萎靡。與模型組比，實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量下降和精神萎靡等體征均有改善。

2.2匹伐他汀對(duì)各組小鼠腎組織病理變化的影響 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠腎臟組織形態(tài)正常，腎小球和腎小管組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊；模型組大鼠腎小球和腎小管上皮細(xì)胞腫脹，球囊黏連，腎小囊腔狹窄；實(shí)驗(yàn)組大鼠`腎小球和腎小管上皮細(xì)胞不同程度腫脹，球囊部分黏連，與模型組比較有改善。見(jiàn)圖1。

PAS染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清楚，基底膜完整；模型組大鼠毛細(xì)血管袢有結(jié)節(jié)狀粉紅色的玻璃樣物質(zhì)沉積；實(shí)驗(yàn)組腎小球結(jié)構(gòu)較清楚，基底膜完整。見(jiàn)圖2。

Masson染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠腎小球及腎小管間質(zhì)形態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)纖維組織增生及膠原纖維沉積；模型組大鼠腎間質(zhì)中可見(jiàn)纖維組織增多，膠原纖維沉積；實(shí)驗(yàn)組大鼠腎小管間質(zhì)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)纖維組織增生。見(jiàn)圖3。

2.3匹伐他汀對(duì)各組大鼠UA水平的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠UA水平(96.82±157.4)明顯升高(P<0.05)；與模型組(42.31±3.47)相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清尿酸水平(58.39±8.97)明顯降低(P<0.05)。

2.4匹伐他汀對(duì)各組大鼠血清MAD含量、SOD、T-AOC、CAT和GSH-Px活性的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清MAD含量明顯升高(P<0.05)，血清SOD、T-AOC活性明顯降低(P<0.05)；與模型組比較， 實(shí)驗(yàn)組大鼠血清MAD含量明顯降低(P<0.05)，血清SOD、T-AOC活性明顯升高(P<0.05)；各組大鼠血清CAT和GSH-Px的活力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

GroupsnSOD(U/ml)T-AOC(U/ml)MDA(nmol/ml)CAT(U/ml)GSH-Px(U/ml)Control group1291.20±4.349.14±0.644.24±0.3765.78±4.86965.33±20.56Model group1277.43±3.451)7.82±0.511)5.20±0.481)63.47±4.02950.34±36.78Exprimental group1288.34±3.532)9.02±0.552)4.63±0.592)62.20±3.84946.37±26.50

Note：Compared with control group，1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

圖1 各組大鼠腎組織HE染色Fig.1 HE staining of renal tissues of rats in each groupNote: A.Control group;B.Model group;C.Experimental group.

圖2 各組大鼠腎組織PAS染色(×400)Fig.2 PAS staining of renal tissue of rates in each group(×400)Note: A.Control group;B.Model group;C.Experimental group.

圖3 各組大鼠腎組織Masson染色(×200)Fig.3 Masson staining of renal tissue of rates in each group(×200)Note: A.Control group;B.Model group;C.Experimental group.

GroupsnIL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)TGF-β1(ng/ml)Cotrol group1214.64±1.7355.84±7.34155.80±9.66 Model group1230.34±2.461)80.67±6.041)224.83±15.021)Experimental group1216.83±2.192)58.90±5.772)170.45±11.062)

Note：Compared with control group，1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

圖4 各組大鼠腎組織免疫組織化學(xué)染色(×100)Fig.4 Immunohistochemical staining of renal tissues of rats in each group(×100)Note: A.Control group;B.Model group;C.Experimental group.

2.5匹伐他汀對(duì)各組大鼠血清炎癥因子水平的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α和TGF-β1水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清IL-6、TNF-α和TGF-β1水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.6匹伐他汀對(duì)各組大鼠腎組織TGF-β1的影響 與對(duì)照組(1 268.52±103.21)相比，模型組大鼠腎組織TGF-β1水平(4 236.63±568.60)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠腎組織TGF-β1水平(2 803.35±449.82)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討論

高尿酸血癥由體內(nèi)嘌呤代謝紊亂引起，因此通過(guò)給予實(shí)驗(yàn)大鼠腺嘌呤和尿酸前體物質(zhì)酵母，可增加大鼠體內(nèi)嘌呤分解酶活性，加速UA合成[8]。研究表明，高尿酸血癥的發(fā)生與機(jī)體氧化應(yīng)激聯(lián)系密切，UA是一種重要的內(nèi)源性抗氧化劑，但UA水平持續(xù)升高會(huì)使體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)加強(qiáng)[9]。血清UA水平升高，可通過(guò)多種途徑破壞機(jī)體氧化-還原平衡，使機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧，損傷組織細(xì)胞，從而降低機(jī)體抗氧化能力，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷的發(fā)生[10]。機(jī)體通過(guò)SOD、T-AOC和GSH-Px等活性酶清除活性氧自由基，從而減少細(xì)胞損傷。SOD是機(jī)體防御過(guò)氧化損害的關(guān)鍵酶，分布于線粒體基質(zhì)和胞質(zhì)，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起重要作用，清除超氧陰離子自由基O2-·，GSH-Px則催化體內(nèi)的過(guò)氧化物還原，MDA是活性氧自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中生成的一種醛類(lèi)物質(zhì)，其含量反映機(jī)體過(guò)氧化程度及受活性氧自由基攻擊損傷的程度，T-AOC是反映總體抗氧化能力及氧化應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度的重要標(biāo)志，是體內(nèi)非酶及酶促系統(tǒng)中抗氧化物質(zhì)的總體水平，包括具有結(jié)合自由基能力的過(guò)氧化氫酶CAT、SOD和GSH-Px等[11-14]。

由于尿酸鹽結(jié)晶在血管壁和腎臟沉積，造成慢性炎癥損害，釋放大量炎癥因子，高尿酸血癥患者TNF-α、IL-6和TGF-β1水平明顯高于健康者[15]。TNF-α、IL-6和TGF-β1水平升高進(jìn)一步加重腎小管和間質(zhì)損傷，使UA排泄障礙。IL-6參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，是高尿酸血癥發(fā)生的重要炎癥介質(zhì)，其分泌量增加可調(diào)控TGF-β1的受體分布，提高TGF-β1的表達(dá)水平，并釋放大量其他炎癥因子，加重組織細(xì)胞損傷[16]。此外TNF-α、IL-6和TGF-β1水平升高會(huì)引起氧化應(yīng)激[17]。

大量研究證明，他汀類(lèi)藥物可減少趨化因子的釋放，減少中性粒細(xì)胞的聚集，抑制炎癥因子、細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用[18-20]。本研究結(jié)果表明，高尿酸血癥大鼠給予匹伐他汀后，腎小球和腎小管上皮細(xì)胞腫脹、球囊部分粘連均得到改善，腎間質(zhì)纖維組織和膠原纖維沉積減少，說(shuō)明匹伐他汀對(duì)腎臟組織有一定保護(hù)作用，與報(bào)道一致。實(shí)驗(yàn)組小鼠血清UA、MAD含量明顯降低，SOD、T-AOC活性升高，說(shuō)明匹伐他汀具有抗氧化作用[21,22]。給予匹伐他汀干預(yù)后血清IL-6、TNF-α和TGF-β1水平明顯降低，腎臟TGF-β1水平明顯降低，發(fā)揮顯著的抗炎作用。

綜上所述，匹伐他汀可控制UA水平，減輕高尿酸血癥所致的氧化應(yīng)激損傷，抑制炎癥因子分泌，但其抗氧化和抗炎的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。