劉海萌 付 冠

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，濱州 256603)

缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CI)又稱腦梗死，是全世界三大致死疾病之一，具有發(fā)病率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)[1,2]。2009年WHO調(diào)查報(bào)告顯示我國(guó)腦卒中發(fā)病率以每年8.7%的速度增長(zhǎng)[3,4]。目前主要采取以支持治療為主的綜合治療來(lái)改善缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能障礙，仍缺乏有效的治療手段。因此，尋找促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)的有效方法一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)隨著干細(xì)胞研究的不斷發(fā)展，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)移植治療缺血性腦卒中獲得了較大關(guān)注。田立平等[5]采用人臍帶血MSCs對(duì)90例腦梗死患者進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)相比單純藥物治療，該方法可進(jìn)一步改善患者神經(jīng)功能缺損癥狀。何霞等[6]采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BM-MSC)移植治療實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血性腦梗死，證實(shí)移植BM-MSCs有助于調(diào)節(jié)大鼠免疫，降低炎癥因子水平，能促進(jìn)神經(jīng)功能早期恢復(fù)。

黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ，AsⅣ)為黃芪中重要的活性成分，是常用的補(bǔ)氣中藥，味甘、性微溫，入肺歸脾經(jīng)，具有良好的補(bǔ)氣、益中、養(yǎng)血、利水消腫、益衛(wèi)固表、斂瘡生肌的功效，被廣泛應(yīng)用于治療缺血性腦血管病。劉海超等[7]研究證實(shí)黃芪甲苷可改善大鼠腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷，緩解免疫功能紊亂。李媛等[8]研究也證實(shí)黃芪甲苷可減輕大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。本研究主要觀察在BM-MSCs移植治療大鼠腦缺血再灌注損傷后，給予AsⅣ灌胃治療是否可進(jìn)一步提升神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 SD大鼠BM-MSCs購(gòu)于上海酶研生物科技有限公司。

1.1.2試劑 AsⅣ(84687-43-4)購(gòu)于成都普利斯生物科技有限公司，純度≥98%；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)于廈門研科生物技術(shù)有限公司；p-STAT-3抗體(sc-293059)、STAT-3抗體(sc-293151)、GAPDH抗體(sc-47724)購(gòu)于圣克魯斯生物技術(shù)；放射免疫測(cè)定試劑盒(SHXFFMDC01)購(gòu)于上海信帆生物科技有限公司；尼氏染色試劑盒(SBJ-0490)購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(230±26)g，SPF級(jí)，飼養(yǎng)于 24℃、相對(duì)濕度50%～60%、光12 h/暗12 h的環(huán)境中，自由進(jìn)食水。術(shù)前禁食12 h，自由飲水。采用抽簽法將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、單獨(dú)細(xì)胞組與細(xì)胞+藥物組，每組15只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理學(xué)要求，符合3R規(guī)則。

1.2方法

1.2.1BM-MSCs的培養(yǎng)與傳代 復(fù)蘇凍存的BM-MSCs，接種于T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入足量的完全培養(yǎng)基、置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第2天更換新鮮的完全培養(yǎng)基，此后每2 d更換新鮮的完全培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%的匯合度時(shí)進(jìn)行消化傳代，每2～3 d換液1次。選擇第3代BM-MSCs進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)。

1.2.2腦缺血再灌注損傷模型的建立 采用線栓法建立腦缺血再灌注損傷模型[9]：10%水合氯醛 40 mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉生效后將大鼠仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，頸部常規(guī)備皮消毒，取頸正中切口，逐層分離，顯露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端與頸外動(dòng)脈，以動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈的分支上做一個(gè)小切口，導(dǎo)入栓線，隨后松開(kāi)動(dòng)脈夾，將魚(yú)線從頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，感覺(jué)到阻力時(shí)停止，以縫合線系住栓線，判定無(wú)活動(dòng)性出血后縫合皮膚，術(shù)后2 h 取出線栓。以神經(jīng)功能評(píng)分1～3分判定為造模成功。

取4組SD大鼠，正常組不做任何處理；其余3組大鼠建立腦缺血再灌注損傷模型。造模后第2天，單獨(dú)細(xì)胞組、細(xì)胞+藥物組尾靜脈注射1 ml骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，約含細(xì)胞數(shù)5×106個(gè)，模型組尾靜脈注射1 ml生理鹽水，細(xì)胞+藥物組灌胃給予黃芪甲苷50 mg/(kg·d)[7]，模型組與單獨(dú)細(xì)胞組灌胃給予等量生理鹽水。如在造模過(guò)程中有動(dòng)物死亡，參照同樣方法造模，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物補(bǔ)齊。

1.2.3實(shí)驗(yàn)取材 給藥7 d后，進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分，評(píng)分后，10%水合氯醛以40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，剖開(kāi)胸腔，將灌流針從左心室插入升主動(dòng)脈，以動(dòng)脈夾固定，在右心耳放血,向右心耳注入生理鹽水，當(dāng)自右心耳流出的液體變清亮后，緩慢灌流40 g/L的多聚甲醛，待肝臟變硬后斷頭取腦，剝?nèi)〈竽X組織，進(jìn)行以下檢測(cè)。

1.2.4神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分 參照Longa等[10]方法進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分，見(jiàn)表1。

1.2.5炎癥因子檢測(cè) 將腦組織放入冰冷的鹽水中，將皮質(zhì)切為2～3 mm小片， 加入pH=4的PBS，均質(zhì)器研磨獲得勻漿液，4℃下3 000 r/min離心15 min，取上清液，利用放射免疫測(cè)定試劑盒檢測(cè)TNF-ɑ與IL-1β濃度。

表1 神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分

Tab.1 Neurological behavioral score

PerformanceScoreNo obvious neurological impairment0 Can't fully extend the right forelimb1 Rotate to the right while walking2Dump to the right while walking3 Can't spontaneously go away,losing consciousness4

1.2.6尼氏染色 取大鼠腦海馬組織，制作冰凍切片，切片厚度3 μm，蒸餾水清洗2 min，尼氏體染色15 min，雙蒸水清洗2次，95%乙醇分化5 s，常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)脂封固，顯微鏡下觀察。

1.2.7腦組織形態(tài)學(xué)觀察 取大鼠腦組織，40 g/L多聚甲醛4℃固定24 h，進(jìn)行切片制作，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察組織病理變化，每張切片隨機(jī)取6個(gè)視野拍照。

1.2.8Western blot檢測(cè) 取腦組織100 mg，加入400 μl蛋白裂解液，制備組織勻漿，采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品，加入6 μl 5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液SDS Reducing Sample Buffer，充分混勻，100℃金屬浴10 min；上樣到 SDS-PAGE 凝膠電泳中分離蛋白,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1～2 h； 加入稀釋的一抗(p-STAT-3抗體、STAT-3抗體、GAPDH抗體)4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗后，加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL顯影、曝光。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分 正常組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分為0，無(wú)神經(jīng)功能損傷；與正常組相比，模型組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，單獨(dú)細(xì)胞組與細(xì)胞+藥物組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 且細(xì)胞+藥物組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分低于單獨(dú)細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分Fig.1 Neurological behavioral scores of rats in each groupNote:*.P<0.05，vs.Model；#.P<0.05，vs.Cell.

2.2腦組織形態(tài)學(xué)觀察 蘇木精-伊紅染色后光鏡下觀察。正常組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯病理變化；模型組可見(jiàn)鏤空篩網(wǎng)狀軟化病灶，間質(zhì)水腫，病灶周圍出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，胞體皺縮，核固縮、碎裂、溶解；單獨(dú)細(xì)胞組腦缺血區(qū)皮質(zhì)病理?yè)p傷減輕，間質(zhì)水腫程度減輕，變性和壞死的細(xì)胞數(shù)量明顯減少；相對(duì)于單獨(dú)細(xì)胞組，細(xì)胞+藥物組病理改變進(jìn)一步減輕，見(jiàn)圖2。

2.3尼氏染色 正常組海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列規(guī)則緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞漿內(nèi)可見(jiàn)豐富的尼氏小體；模型組海馬區(qū)錐體細(xì)胞缺失，排列混亂，細(xì)胞輪廓不清晰，胞漿內(nèi)尼氏小體縮小；相較于模型組，單獨(dú)細(xì)胞組與細(xì)胞+藥物組海馬區(qū)椎體細(xì)胞明顯增加，排列規(guī)則有序，細(xì)胞輪廓也比較清晰，胞漿內(nèi)尼氏小體變大，見(jiàn)圖3。

2.4炎癥因子濃度 與正常組對(duì)比，模型組TNF-α與IL-1β濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組對(duì)比，細(xì)胞組、細(xì)胞+藥物組TNF-α與IL-1β濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與細(xì)胞組對(duì)比，細(xì)胞+藥物組TNF-α與IL-1β濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.5Western blot檢測(cè) 與正常組對(duì)比，模型組、細(xì)胞組、細(xì)胞+藥物組STAT-3蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化；與正常組對(duì)比，模型組p-STAT-3蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組對(duì)比，細(xì)胞組、細(xì)胞+藥物組p-STAT-3蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與細(xì)胞組對(duì)比，細(xì)胞+藥物組p-STAT-3蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖2 各組腦組織形態(tài)學(xué)觀察(蘇木精-伊紅染色，×100)Fig.2 Histomorphological observation of brain in each group(HE staining,×100)

圖3 各組腦組織海馬區(qū)尼氏染色(×200)Fig.3 Nissl staining of hippocampus in each group (×200)

圖4 各組腦組織炎性因子水平(n=3)Fig.4 Inflammatory factors in brain tissue of each group (n=3)Note:*.P<0.05，vs.Control;#.P<0.05，vs.Model;△.P<0.05，vs.Cell.

圖5 各組腦組織STAT-3與p-STAT-3蛋白表達(dá)(n=3)Fig.5 Expression of STAT-3 and p-STAT-3 protein in brain tissue of each group (n=3)Note:*.P<0.05，vs.Control;#.P<0.05，vs.Model;△.P<0.05，vs.Cell.

3 討論

CI是由多種病因引起的腦動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，進(jìn)一步導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)興奮性毒性、線粒體功能失調(diào)、氧化應(yīng)激、炎癥、離子失衡及酸中毒現(xiàn)象，最終導(dǎo)致腦組織不可逆性損傷，神經(jīng)細(xì)胞壞死，出現(xiàn)神經(jīng)功能及認(rèn)知功能缺失。臨床研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動(dòng)脈閉塞是缺血性腦血管疾病常見(jiàn)的發(fā)病部位，通過(guò)大腦中動(dòng)脈栓塞而制作的局灶性腦缺血再灌注模型是目前最接近于人類的缺血性腦卒中模型，也是體內(nèi)評(píng)價(jià)抗腦缺血藥物效果和探究相應(yīng)機(jī)制的重要模型[11]。由于大鼠大腦中動(dòng)脈的解剖分布與基底節(jié)區(qū)血流供應(yīng)與人類具有極高的相似度，并且大鼠血管變異程度小、抗感染能力強(qiáng)、成本低、存活時(shí)間較長(zhǎng)，成為實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)階段常選用的腦缺血實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇SD大鼠作為腦缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，大多數(shù)人認(rèn)為CI的病理基礎(chǔ)是氣虛血瘀、脈絡(luò)閉阻，以氣虛為本，血瘀為標(biāo)，故缺血性卒中多呈本虛標(biāo)實(shí)，中藥治療以“補(bǔ)氣活血通絡(luò)”為主。而AsⅣ為黃芪中重要的活性成分，是常用的補(bǔ)氣中藥，可用于治療CI。體外研究顯示，AsⅣ可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)BM-MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞[12，13]。因此，本研究采用動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察AsⅣ對(duì)BM-MSCs移植治療腦缺血再灌注損傷的影響。采用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型后，大鼠神經(jīng)功能嚴(yán)重受損，海馬區(qū)錐體細(xì)胞缺失，排列混亂，細(xì)胞輪廓不清晰，胞漿內(nèi)尼氏小體縮小，神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分明顯升高，炎癥因子水平明顯升高，提示實(shí)驗(yàn)造模成功。BM-MSCs移植后，腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)病理改變有所減輕，海馬區(qū)椎體細(xì)胞明顯增加，排列規(guī)則有序，細(xì)胞輪廓也比較清晰，胞漿內(nèi)尼氏小體變大，神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分明顯降低，炎癥因子水平明顯降低，提示BM-MSCs對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦神經(jīng)具有保護(hù)作用，與以往的研究結(jié)果一致[14，15]。在BM-MSCs移植治療的基礎(chǔ)上，AsⅣ可進(jìn)一步提升骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果，提示AsⅣ可進(jìn)一步增強(qiáng)BM-MSCs的腦神經(jīng)保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)JAK-STAT信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[16]。STATs是JAK-STAT 信號(hào)通路中JAKs的下游底物，STAT-3蛋白是其中重要成員之一，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)。但目前對(duì)于STAT-3在腦缺血再灌注損傷中的作用還沒(méi)有定論，有學(xué)者認(rèn)為STAT-3在腦缺血再灌注損傷后活化，參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生與發(fā)展[17]；還有學(xué)者認(rèn)為STAT-3活化可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[18，19]。本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織p-STAT-3蛋白表達(dá)升高，提示STAT-3蛋白參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)生；而B(niǎo)M-MSCs移植可降低腦缺血再灌注損傷引發(fā)的p-STAT-3蛋白表達(dá)升高，AsⅣ可進(jìn)一步增強(qiáng)BM-MSCs對(duì)p-STAT-3蛋白表達(dá)的抑制作用。因此推測(cè)AsⅣ進(jìn)一步增強(qiáng)BM-MSCs修復(fù)大鼠腦缺血再灌注損傷效果的作用途徑可能與降低p-STAT-3蛋白表達(dá)有關(guān)。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制與再生機(jī)制非常復(fù)雜，關(guān)于AsⅣ如何作用于STAT-3信號(hào)通路且是否還有其他因子的參與還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。