楊行，韓瑞，張文波，殷貴虎，唐云云

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

鴨作為主要家禽之一，是我國傳統(tǒng)和特色養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分。隨著國內(nèi)外市場需求旺盛，鴨養(yǎng)殖量和規(guī)模不斷增加，引種和交易頻繁，從業(yè)人員素質(zhì)參差不齊，使疫病帶來的經(jīng)濟(jì)損失風(fēng)險(xiǎn)也愈加明顯。如何科學(xué)防控疫病、降低風(fēng)險(xiǎn)是目前養(yǎng)鴨業(yè)面臨的重要問題。

圓環(huán)病毒病是一種危害巨大的免疫抑制疾病，可感染多種動物，主要導(dǎo)致動物機(jī)體免疫系統(tǒng)損失，并引起嚴(yán)重的繼發(fā)感染，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。圓環(huán)病毒是無囊膜的單股DNA病毒。鴨圓環(huán)病毒(duck circovirus, DuCV)由德國學(xué)者HATTERMANN等[2]在2003年首次報(bào)道，是目前已知感染鴨最小的病毒，目前仍無人工培養(yǎng)成功的報(bào)道?；蚪M與分子遺傳學(xué)研究表明，DuCV可分為2 個(gè)基因型：DuCV-1、DuCV-2，核苷酸序列相似性低于92%，編碼氨基酸相似性低于73%，其致病力差異明顯，DuCV-1 是國內(nèi)主要的致病基因型[3-5]。鴨圓環(huán)病毒病(duck circovirus disease，DCVD)是由DuCV引起鴨的一種慢性消耗性和免疫抑制性傳染病，主要表現(xiàn)為鴨體生長不良、鴨體器官萎縮以及繼發(fā)嚴(yán)重的細(xì)菌感染，給鴨場造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[6]。國內(nèi)外多次報(bào)道此病，也進(jìn)行了大量的研究，但DuCV致病機(jī)制仍不清楚，也無商品化的疫苗，因此了解該病的流行情況、病毒的分子特點(diǎn)等，對科學(xué)防控該病有著重要的實(shí)際意義。

江西省是國內(nèi)重要的養(yǎng)鴨區(qū)域之一，是省內(nèi)部分地區(qū)重要的產(chǎn)業(yè)，老病未除、新病不斷發(fā)生，給養(yǎng)鴨業(yè)造成極大的損失。關(guān)于黃病毒病、鴨腺病毒感染等報(bào)道較多，但對DuCV的流行情況和分子特點(diǎn)報(bào)道較少。本試驗(yàn)對江西省養(yǎng)鴨集中的部分地區(qū)的8個(gè)規(guī)?；B(yǎng)鴨場病死鴨的DuCV分子流行情況進(jìn)行初步調(diào)查，并對核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹及相似性分析，初步了解DuCV的分子流行情況和毒株基因型，豐富了江西地區(qū)DCVD流行病學(xué)資料，對江西地區(qū)鴨圓環(huán)病毒病等鴨病防控具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

江西省3個(gè)地區(qū)(撫州、九江、宜春)內(nèi)8個(gè)養(yǎng)殖規(guī)模較大的鴨場的病死鴨，無菌采集肝臟、肺臟和法氏囊共42份， -80 ℃保存。

1.1.2 試劑

病毒基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；DNA 2000 Maker(全式金生物科技有限公司)；2× FastTaqPreMix(tolobio)。

1.1.3 引物合成

根據(jù)GenBank上登錄的DuCV全基因組序列和文獻(xiàn)[7]進(jìn)行設(shè)計(jì)：DuCV-F：5′-TTA CRG GCG MTT GTM CTC- 3′，DuCV-R：5′-TAM TTG RTT TCM GCG GXA- 3′，擴(kuò)增片段大小605 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 組織DNA提取

參照病毒基因組DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 PCR

以提取的病毒DNA為模板，PCR反應(yīng)體系為25μL：2×FastTaqPreMix 12.5μL，上下游引物各0.5μL， dd H2O 10.5μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸25 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測。

1.2.3 序列測定

5個(gè)陽性檢出鴨場各選擇1份陽性PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.4 序列分析及進(jìn)化樹繪制

在線BLSAT比對分析所測序列，利用MEGA 10和DNAstar軟件分析所測序列與已發(fā)表DUCV相應(yīng)序列的相似性，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。參考的序列信息見下表(表1)。

表1 文章所用序列信息表

名稱登錄號基因型來源年份D12MR021KC851823.1DuCV-1韓國2014AQ0901GU014543.DuCV-1南京2009GX180511MK814578.1DuCV-1廣東2019GX190510MK814581.1DuCV-1廣西2019JSPX03EMF627688.1DuCV-1山東2018WF0803GU131342.1DuCV-1山東2009DU095HM162349.1DuCV-1北京201133753-52DQ100076.1DuCV-1美國2007DUCVAY228555DuCV-1德國2003FC35/2012KC460527.1DuCV-1廣西2014NN13/2012KC460532.1DuCV-1廣西2014GX190512MK814583.1DuCV-1廣東2019YN190415MK814589.1DuCV-1廣東2019SDLY0201MF627690.1DuCV-1山東2018TC1/2002AY394721.1DuCV-2臺灣2006YN180505MK814584.1DuCV-2云南2019WS-GD01FJ554673.1DuCV-2廣東2009DUCV-FuJian-2011KF726087.1DuCV-2福建2011GX1104JX241046.1DuCV-2廣西2011GD190401MK814575.1DuCV-2廣東201911-1KF941310.1DuCV-2廣東2014

2 結(jié)果

2.1 DuCV的PCR檢測

將提取的病毒DNA進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳。結(jié)果，部分樣品在約600bp處有明顯的條帶，與預(yù)期大小基本一致(圖1)。8家規(guī)模化鴨場，5個(gè)場有陽性樣品檢出；采集的42份樣品，18份為陽性樣品，陽性率為42.9%(表2)。

M.DL2000 DNA Marker；1，2.陰性樣品；3～8.陽性樣品；9，10.陰性樣品

圖1 部分樣品DuCV的 PCR檢測結(jié)果

表2 8個(gè)規(guī)?；唸龅腄uCV感染情況

養(yǎng)殖場12345678總計(jì)病料數(shù)5442838842檢出數(shù)3430305018陽性率/%6010075037.5062.5042.9

2.2 序列測定與分析

送檢5份樣品進(jìn)行序列測定。結(jié)果，序列長度均為605 bp (分別命名為：JX-DuCV1，JX-DuCV2，JX-DuCV3，JX-DuCV4，JX-DuCV5)，BLAST比對分析，所測序列與GenBank上登錄的DuCV-1相應(yīng)序列的相似性均在95%以上，而與DuCV-2相應(yīng)序列的相似性均在85%～89%之間。

2.3 相似性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，5株DuCV均屬于DuCV-1型，其中JX-DuCV2、JX-DuCV4與DuCV 1b亞型位于同一進(jìn)化分支，JX-DuCV1、JX-DuCV3和JX-DuCV5與DuCV 1a亞型位于同一進(jìn)化分支(圖2)。

圖2 DuCV部分序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

核苷酸相似性分析，5株DuCV基因片段核苷酸序列之間的相似性均在97%以上，且與參考的DuCV-1型相應(yīng)核苷酸序列相似性均在95%以上，與參考的DuCV-2型核苷酸序列相似性均低于90%，見圖3。

圖3 DuCV部分核苷酸相似性分析

將所測的序列與GenBank中登錄的DuCV-1型和DuCV-2型相應(yīng)序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果， DuCV-1型和2型間有多個(gè)核苷酸位點(diǎn)不一致；所測序列中JX-DuCV4的25位核苷酸和38位核苷酸與DuCV-2型一致，43位與DuCV-2型均缺失1個(gè)核苷酸A，其他位點(diǎn)均與DuCV-1型的位點(diǎn)一致；其他所測的4條序列均與DuCV-1型的位點(diǎn)變異一致(表3)。

表3 所測DuCV序列片段、DuCV-1型、DuCV-2型相應(yīng)序列的突變位點(diǎn)分析

核苷酸位點(diǎn)DuCV-1DuCV-2JX-DuCV4核苷酸位點(diǎn)DuCV-1DuCV-2JX-DuCV425缺AA363TG28GA365TG32AT366CG37CG367CT38TGG382TC39TAG383GC40AG385TG41GC410AC43C缺C412GC44A缺433GC55GT436GT61CT

3 討論

2003年HATTERMANN等[2]首次報(bào)道鴨圓環(huán)病毒病及DuCV，2006年CHEN等在中國臺灣檢測到該病毒[8]，隨后在山東、廣西、浙江、廣東等省也陸續(xù)報(bào)道了該病[9-12]。DuCV可感染各種日齡及各種品種的鴨，感染后可導(dǎo)致免疫抑制，鴨群單獨(dú)感染DuCV后死亡率不高[13]，但易引起細(xì)菌和病毒性疾病的繼發(fā)感染而導(dǎo)致死亡率升高。粟裕瓊等[14]對DuCV陽性樣品進(jìn)行多種疾病的檢測，發(fā)現(xiàn)DUCV單獨(dú)感染僅占18.42%，多重感染占81.58%。DuCV對養(yǎng)鴨業(yè)危害較大，且常以隱性感染存在，容易被忽視，造成嚴(yán)重?fù)p失，因此，在生產(chǎn)過程中需對DuCV加強(qiáng)關(guān)注。

DuCV是一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，其研究還不深入，目前沒有合適的體外培養(yǎng)體系；其診斷方法包括血清學(xué)檢測方法及病原學(xué)檢測方法，其中PCR具有較強(qiáng)的敏感性、易操作，且成本較低，適合分子流行病學(xué)調(diào)查。本試驗(yàn)中，通過對江西省8個(gè)規(guī)?；唸龅牟∷励啒悠愤M(jìn)行DuCV的PCR檢測，結(jié)果，42份樣品中有18份陽性樣品檢出，總陽性率為42.9%，且8個(gè)養(yǎng)殖場中有5個(gè)鴨場有陽性樣品檢出，表明江西省規(guī)模養(yǎng)鴨場的圓環(huán)病毒陽性場比率較高，且病死鴨中的檢出率達(dá)到42.9%，應(yīng)引起養(yǎng)鴨場的足夠重視。孫文超[15]對云南及廣西鴨圓環(huán)病毒檢測陽性率為5%；屈素潔等[16]對廣西3個(gè)市DuCV檢測陽性率為18%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，江西地區(qū)DuCV陽性率要高于其他省份的研究報(bào)道，說明DuCV在江西地區(qū)流行較為廣泛。

根據(jù)核苷酸序列差異，可將DuCV分為DuCV-1型和DuCV-2型，DuCV-1型又可分為1a、1b和1c 3個(gè)亞型[17]；DuCV-1型和DuCV-2型在多個(gè)核苷酸位點(diǎn)存在差異。本課題組前期對DuCV-1型和DuCV-2型的全基因組進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，在DuCV基因組的5′端非編碼區(qū)和相鄰的部分ORF1片段(605 bp)，變異性較大，用該片段構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹與用全基因組構(gòu)建的進(jìn)化分析樹基本一致，故本試驗(yàn)選擇該片段進(jìn)行DuCV的檢測靶標(biāo)和分析。

本試驗(yàn)對5家陽性場各隨機(jī)選擇1份陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹及核苷酸相似性分析。5株DuCV均為DuCV-1型，JX-DuCV2與JX-DuCV4屬于1b亞型，JX-DuCV1、JX-DuCV3和JX-DuCV5屬于1a亞型；核苷酸序列相似性分析顯示，5株DuCV相似性均在97%以上，與DuCV-2型相似性均在90%以下。結(jié)果表明，江西省內(nèi)鴨場DuCV以DuCV-1型流行為主，且分為2個(gè)亞型，與國內(nèi)其他研究報(bào)道有一定差異。李志國[18]、王鑫[19]均檢測出了明顯的DuCV-1與DuCV-2共感染，這可能與采樣數(shù)量及地區(qū)差異有關(guān)。

本試驗(yàn)在剖檢病死鴨過程中，發(fā)現(xiàn)部分鴨存在明顯的細(xì)菌繼發(fā)感染，導(dǎo)致用藥效果不佳，表明DuCV可能是某些細(xì)菌感染或病毒性疾病暴發(fā)的誘因。因目前尚無預(yù)防鴨圓環(huán)病毒病的疫苗，且流行程度較高，所以在養(yǎng)鴨過程中必須加強(qiáng)對DuCV的重視度，加強(qiáng)種鴨、種蛋、孵化、養(yǎng)殖等過程中的飼養(yǎng)管理及對各種疾病的科學(xué)防控，避免DuCV感染導(dǎo)致其他疾病暴發(fā)，減少經(jīng)濟(jì)損失。