田萬年，宋旗，孫凰員，鄭秀紅

(1. 吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物科技學院，吉林 吉林 132101；2. 吉林省龍井市德新鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，吉林 龍井 133400)

羊泰勒蟲病是由泰勒蟲寄生于羊紅細胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞內(nèi)引起的經(jīng)蜱傳播血液原蟲病[1]。本病以體表淋巴結(jié)腫大、貧血、血紅蛋白尿為主要特征，對羔羊和外地引進羊危害嚴重[2]。羊泰勒蟲病的診斷一般為血涂片染色后，通過顯微鏡觀察紅細胞內(nèi)蟲體確診，近年來隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，相繼建立了檢測羊泰勒蟲PCR和熒光定量PCR方法[3-4]。傳統(tǒng)病原學血液涂片鏡檢受人為因素影響較大，容易出現(xiàn)漏檢和誤診，PCR技術(shù)具有特異性強、靈敏度高的特點，已廣泛應用于羊泰勒蟲病的診斷和流行病學分析[5-6]。泰勒蟲主要表面蛋白(major piroplasm surface protein, MPSP)是泰勒蟲感染紅細胞階段蟲體分泌的一種膜內(nèi)蛋白，是泰勒蟲所特有的膜表面蛋白, 其編碼的基因在遺傳分類和分子診斷方面具有較好應用價值[7-8]。目前，國內(nèi)尚未見套式PCR檢測方法應用于羊泰勒蟲病診斷的研究報道。本試驗利用羊泰勒蟲MPSP基因的特異性，建立了羊泰蟲套式PCR檢測方法，為基層獸醫(yī)工作人員對該病的診斷提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

30份綿羊抗凝血于2017年5月采自吉林省琿春地區(qū)，同時用載玻片制作血涂片供染色鏡檢。

1.2 血液涂片染色

制成的血液涂片滴加甲醇固定，放入裝有吉姆薩染液的染缸中，室溫染色6 h，然后取出血液涂片用蒸餾水沖洗，自然晾干后顯微鏡鏡檢。

1.3 基因組DNA的提取

臨床樣本綿羊血液DNA提取按照天根生化科技有限公司血液DNA提取試劑盒說明書進行操作。羊巴貝斯蟲(Babesia)、羊無漿體(Anaplasmaovis)、弓形蟲(Toxoplasmagondii)基因組DNA由日本帶廣畜產(chǎn)大學玄學南教授惠贈。

1.4 引物設計與合成

根據(jù)GenBank 收錄的梨形蟲MPSP序列(GQ281044)，利用引物設計軟件設計兩對特異性引物(見表1)。

表1 MPSP基因引物序列

引物名稱引物序列(5'-3')產(chǎn)物長度/bp退火溫度/℃MPSP外引物P1: ATGTTGTCCAAGAGATCATTCP2: CTAGAAATAGTAGGATACTGCG85255MPSP內(nèi)引物N1: GAAGAAGAGCGACAAGGAATGN2: GATACTGCGAGTAAGGCGATG49258

1.5 PCR擴增

先用外引物P1和P2進行第一輪PCR擴增，取擴增出的產(chǎn)物1 μL為模板，再用內(nèi)引物N1和N2進行第二輪PCR擴增。反應程序：預變性溫度為95 ℃ 5 min，變性溫度為94℃ 45 s，退火溫度為53 ℃ ～60 ℃ 40 s，延伸溫度為72 ℃ 1 min，循環(huán)數(shù)為30個；最后延伸溫度為72 ℃ 5 min。

1.6 目的基因序列測定

第一輪陽性PCR產(chǎn)物回收純化，與克隆載體T載體連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)鑒定為陽性的質(zhì)粒送大連寶生物工程技術(shù)公司進行測序。

1.7 特異性試驗

應用所建立的套式PCR方法分別檢測無漿體、羊巴貝斯蟲、羊泰勒蟲與弓形蟲的DNA，以評價該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗

將帶有MPSP基因的質(zhì)粒用分光光度計測量濃度后，對其進行10倍倍比稀釋，濃度為106～100拷貝數(shù)，分別進行套式PCR和普通PCR擴增，對比最低檢測濃度進行對比。

1.9 臨床樣本檢測

對30份綿羊血液進行套式PCR檢測，同時應用田萬年等[9]報道的普通PCR檢測方法、血液涂片法平行檢測，并比較檢測結(jié)果，評價羊泰勒蟲感染情況。

2 結(jié)果

2.1 血涂片鏡檢

綿羊血涂片染色后，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)梨籽形和點狀羊泰勒蟲蟲體，見圖1。

圖1 血液涂片吉姆薩染色鏡檢結(jié)果(1 000×)

2.2 PCR擴增

DNA經(jīng)外引物PCR擴出約為852 bp目的條帶，退火溫度為55 ℃；經(jīng)內(nèi)引物PCR擴出約為492 bp目的條帶，最佳退火溫度為58 ℃(見圖2)。

M. DL 2000 DNA Marker；1. 第1輪PCR 產(chǎn)物；2，4.空白對照；3.第2輪PCR擴增產(chǎn)物

圖2 套式PCR擴增結(jié)果

2.3 目的基因序列測定

經(jīng)序列測定顯示，所測得的羊泰勒蟲MPSP基因與NCBI網(wǎng)站收錄的羊呂氏泰勒蟲(GQ281044)核苷酸同源性為100%。

2.4 特異性試驗

該方法可特異性檢測出羊泰勒蟲基因組DNA，而以羊巴貝斯蟲、弓形蟲和綿羊無漿體的DNA為模板時未能擴增出相應基因片斷(圖3)，具有較好的特異性。

M. DL 2000 DNA Marker；1.羊泰勒蟲；2.羊巴貝斯蟲；3.弓形蟲；4.無漿體

圖3 特異性PCR擴增

2.5 敏感性試驗

應用所建立的套式PCR和普通PCR同時檢測被稀釋的質(zhì)粒DNA，普通PCR檢測質(zhì)粒DNA的最低濃度為103copies/μL(見圖4)；套式PCR檢測質(zhì)粒DNA最低濃度為1 copies/μL(見圖5)。

M. DL 2000 DNA Marker；1～7. 106～100copies/μL；8. 空白對照

圖4 普通PCR敏感性

M. DL 2000 DNA Marker；1～7. 106～100copies/μL；8. 空白對照

圖5 套式PCR敏感性

2.6 臨床樣本檢測

通過對30份綿羊血液樣本的羊泰勒蟲檢測結(jié)果(見表2)顯示，套式PCR檢測陽性樣本14份，高于普通PCR(12份)和血液涂片染色(7份)，三者間陽性符合率為100%。

表2 臨床樣本檢測結(jié)果

方法被檢數(shù)陽性數(shù)陰性數(shù)陽性率/%套式PCR30141646.67普通PCR30121840.00血液涂片3072223.33

3 討論

我國最早發(fā)現(xiàn)羊泰勒蟲是在1958年，目前已在多個省份都有該病的流行報道，給養(yǎng)羊業(yè)造成較大的損失[9]。羊感染一定數(shù)量泰勒蟲才會表現(xiàn)出臨床癥狀，多表現(xiàn)為隱性感染。羊感染該蟲主要表現(xiàn)為免疫器官受損，引發(fā)免疫抑制，免疫功能下降，嚴重影響生產(chǎn)性能。對羊泰勒蟲病原的收集與鑒定是防治該病的基礎，羊泰勒蟲病的診斷多采用血液涂片鏡檢方法，該方法需要檢查人員掌握各種寄生蟲形態(tài)學方面的知識，因此不適用基層獸醫(yī)人員對該病的臨床診斷。

目前，國內(nèi)針對羊泰勒蟲建立了多種分子生物學檢測方法。盛明宏等[3]建立了以18S rRNA為目的基因的PCR檢測方法，敏感性能達到0.12fg DNA；田萬年等[4]建立了以18S rRNA為目的基因的羊泰勒蟲熒光定量PCR方法，最低可檢測2.08×101copies/μL，比普通PCR敏感100倍。為提高套式PCR的特異性和敏感性，本研究所選的目的基因為泰勒蟲特有MPSP基因，該方法最低檢測限量為1拷貝數(shù)，是普通PCR的1 000倍，具有較好的特異性。應用本試驗建立的套式PCR方法通過對30份臨床血液樣本檢測，陽性率為46.6%(14/30)，高于普通PCR(40.00%，12/30)和血液涂片染色(23.33%，7/30)，三者間陽性符合率為100%。綜上，本研究所建立的套式PCR方法具有較好的敏感性、特異性和準確性，為獸醫(yī)人員對羊泰勒蟲病的診斷和流行病學調(diào)查提供了有效手段。