王利利，張凱睿，范云鵬，劉迎秋，麻武仁，張為民，宋曉平

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，養(yǎng)殖業(yè)在大規(guī)模的擴(kuò)增，而由細(xì)菌引起的疾病嚴(yán)重制約畜牧業(yè)的的發(fā)展。其中大腸埃希菌和沙門菌可引起畜禽腸道感染及嚴(yán)重的腹瀉性疾病，且這兩種致病菌易產(chǎn)生耐藥性[1-3]；金黃色葡萄球菌可引起心包炎、皮膚炎、肺炎等多種疾病[4]；鏈球菌可引起奶牛乳房炎、豬鏈球菌病等[5-6]。臨床上常使用抗菌藥防治細(xì)菌性感染疾病，但是所帶來(lái)的藥物殘留及耐藥性也日趨嚴(yán)重，中草藥因其資源豐富、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，成為替代抗生素的重要途徑[7]。

鵝掌楸屬(Liriodendron)植物是傳統(tǒng)的藥用植物，具有很高的藥用價(jià)值?！度珖?guó)中草藥匯編》記載以中國(guó)鵝掌楸(Liriodendronchinense)的樹(shù)皮及樹(shù)根入藥，能夠祛風(fēng)除濕，止咳消喘，用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，風(fēng)寒咳嗽等病癥[8]。李曉娜等[9]研究表明，北美鵝掌楸(L.tulipifera)葉乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、枯草芽孢桿菌等臨床分離株有不同程度抑菌；張悅等[10]通過(guò)研究6種植物粗提物對(duì)大腸桿菌的抑制作用，篩選出鵝掌楸乙醇提取物和水提物的抑制率達(dá)到70%以上。現(xiàn)代研究表明，鵝掌楸屬植物主要含有生物堿、倍半萜、黃酮、苯丙素等成分，具有抗菌、抗瘧疾、抗腫瘤等作用[11]。本試驗(yàn)采用系統(tǒng)溶劑法萃取得到雜種鵝掌楸(L.chinense×tulipifera)葉醇提物的不同部位，并通過(guò)瓊脂平板法和微量肉湯稀釋法檢測(cè)各部位的抗菌作用，以期為進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物

雜種鵝掌楸樹(shù)葉，2018年05月11日采自西北農(nóng)林科技大學(xué)南校區(qū)鵝掌楸路，清洗后自然陰干，粉碎過(guò)20目篩，密封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗(yàn)菌株

大腸埃希菌 ATCC25922、沙門菌 CMCC(B)50071、金黃色葡萄球菌 ATCC6538、無(wú)乳鏈球菌 ATCC12386，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌臨床分離株，從患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮分泌物中分離得到；沙門菌臨床分離株，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供。

1.1.3 主要試劑

無(wú)水乙醇(批號(hào)2019041002)，石油醚(批號(hào)2019041701)，乙酸乙酯(批號(hào)2018011001)，正丁醇(批號(hào)2019012101)，二甲基亞砜(批號(hào)2018042601)，吐溫-80(批號(hào)201801240)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；氯仿，批號(hào)180030，洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯(批號(hào)20180330)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂(批號(hào)20161016)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胎牛血清，批號(hào)18090505，浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制備

稱取雜種鵝掌楸樹(shù)葉粉末200 g，置于圓底燒瓶中，使用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇加熱回流提取4次，每次2 h，藥渣用60%的乙醇提取2次，每次2 h，過(guò)濾合并濾液，減壓濃縮，得醇提浸膏57.15 g。浸膏用適量水分散，依次用石油醚(60～90 ℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3～4次，每次3～4 h，減壓濃縮并回收各部位溶劑，干燥后分別制得各部位提取物[12]。其中石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物分別為9.25、2.11、1.65、10.25及25.20 g。石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位提取物用3% DMSO和3%吐溫-80溶解，水部位提取物用蒸餾水溶解，在超凈工作臺(tái)中過(guò) 0.22μm 微孔濾膜，分別配成質(zhì)量濃度為 10 mg/mL 的藥液。干凈玻璃棒分別蘸取各藥液，點(diǎn)在pH試紙的中部，待試紙變色后，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)比色卡比較，各藥液pH值均在6～8之間。

1.2.2 體外抗菌試驗(yàn)

供試菌液的制備:在超凈工作臺(tái)中，使用接種環(huán)將大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，鏈球菌接種于含血清的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，然后挑取大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌的單菌落接種于無(wú)菌普通肉湯中，鏈球菌單菌落接種于在含血清的營(yíng)養(yǎng)肉湯上，于37 ℃，180 r/min搖床中培養(yǎng)6 h后，用生理鹽水將菌液校正至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)[13]。

抑菌圈的測(cè)定:采用瓊脂平板打孔法，使用移液槍分別吸取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌受試菌液100 μL，加于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，鏈球菌受試菌液 100 μL，加于含血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，迅速用玻璃涂布器在平板上均勻涂布菌液，然后在瓊脂平板上均勻打孔，孔徑6 mm，孔間距>20 mm，在酒精燈上迅速加熱，封底，將鵝掌楸不同部位提取物的受試藥液100 μL加入到各個(gè)孔中，并設(shè)置溶劑對(duì)照，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，觀察結(jié)果，每種供試菌抑菌試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)量抑菌圈平均值[14]。判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)抑菌圈直徑≥20 mm時(shí)，表示極度敏感；當(dāng)15 mm≤抑菌圈直徑<20 mm時(shí)，表示高度敏感；當(dāng)10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm時(shí)，表示中度敏感；當(dāng)6 mm≤抑菌圈直徑<10 mm時(shí)，表示低度敏感或者耐藥[15]。

最小抑菌和殺菌濃度的測(cè)定:采用微量肉湯稀釋法測(cè)定鵝掌楸不同部位提取物的供試藥液對(duì)不同菌株的最小抑菌濃度(MIC)。具體方法是：使用營(yíng)養(yǎng)肉湯將菌液稀釋100倍[16]，然后接種于96孔培養(yǎng)板的1～10 孔，每孔接種100 μL，之后將供試藥物加至第1孔，吹吸幾次，使孔內(nèi)溶液混勻，吸出100 μL加至第2孔，依次進(jìn)行倍比稀釋，最后第9 孔中吸出100 μL棄掉。其中第10孔加入100 μL 3% DMSO和3%吐溫-80，混勻后吸出100 μL棄掉，作為溶劑對(duì)照，第11孔為只加營(yíng)養(yǎng)肉湯100μL的對(duì)照孔，檢測(cè)培養(yǎng)基是否污染，第 12 孔為只加菌液的對(duì)照孔，檢測(cè)菌液是否生長(zhǎng)良好，重復(fù)3次[17]。接種完成后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察其MIC，每孔加入5 μL 4% TTC，放置一段時(shí)間，觀察各孔是否變紅，未變紅的最后一孔的濃度為最小抑菌濃度。將最低抑菌濃度以上的幾個(gè)濃度細(xì)菌接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，觀察，菌落數(shù)小于5個(gè)的最小稀釋度的藥物濃度即為最低殺菌濃度(MBC)[18]。

2 結(jié)果

2.1 雜種鵝掌楸體外抑菌圈直徑測(cè)定

鵝掌楸石油醚部位提取物對(duì)沙門菌、金黃色葡萄球菌參考菌株有中等抗菌作用，抑菌圈直徑分別為 11.0、10.0 mm；氯仿部位提取物對(duì)沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌參考菌株有強(qiáng)抗菌作用，抑菌圈直徑分別為18.0、16.0、17.0 mm；乙酸乙酯部位提取物對(duì)沙門菌參考菌株有中等抗菌作用，抑菌圈直徑為10.0 mm；石油醚、氯仿、乙酸乙酯部位提取物對(duì)大腸埃希菌參考菌株，乙酸乙酯部位提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌參考菌株，正丁醇、水部位提取物對(duì) 4 種供試參考菌株均無(wú)抑菌作用，抑菌圈直徑為 6.0 mm(表1)。

表1 雜種鵝掌楸部位提取物對(duì)參考菌株的抑菌圈直徑 (mm)

鵝掌楸氯仿部位提取物對(duì)沙門菌臨床分離株有中等抗菌作用，抑菌圈直徑為11.0 mm；對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌臨床分離株有強(qiáng)抗菌作用，抑菌圈直徑分別為15.0、16.0 mm；氯仿部位提取物對(duì)大腸埃希菌臨床分離株，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物對(duì) 4 種供試臨床分離株均無(wú)抑菌作用，抑菌圈直徑為 6.0 mm(表2)。

表2 鵝掌楸部位提取物對(duì)臨床分離菌株的抑菌圈直徑 mm

2.2 鵝掌楸各部位提取物最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

石油醚部位提取物對(duì)大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌參考菌株的MIC分別為5、1.25、1.25、2.5 mg/mL，MBC分別為5、2.5、2.5、2.5 mg/mL；氯仿部位提取物MIC分別為5、0.625、0.312 5、0.625 mg/mL，MBC分別為5、1.25、0.312 5、1.25mg/mL；乙酸乙酯部位提取物MIC均別為2.5 mg/mL，MBC 分別為 2.5、5、5、5 mg/mL(表3)。

表3 鵝掌楸部位提取物對(duì)參考菌株的MIC和MBC mg/mL

石油醚部位提取物對(duì)大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌臨床分離株的 MIC分別為 5、2.5、1.25及2.5 mg/mL，MBC分別為 5、5、2.5及2.5 mg/mL；氯仿部位提取物MIC分別為 5、1.25、0.312 5、0.62 5 mg/mL，MBC分別為 5、2.5、0.312 5及1.25 mg/mL；乙酸乙酯部位提取物 MIC分別為 2.5、5、1.25、2.5 mg/mL，MBC分別為 2.5、5、5及5 mg/mL(表4)。

表4 鵝掌楸部位提取物對(duì)臨床分離菌株的MIC和MBC mg/mL

3 討論

中藥化學(xué)成分及其復(fù)雜，每味中藥都含有多類化學(xué)成分，在進(jìn)行中藥活性成分提取時(shí)，通常依據(jù)相似相溶的原理來(lái)制備提取物[19]。楊國(guó)旭[20]對(duì)雜交鵝掌楸莖皮的醇提物進(jìn)行了不同溶劑溶解分段，并證明了雜交鵝掌楸莖皮的二氯甲烷粗提部分對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，抑菌率48.8%。趙亞琦等[21]用瓊脂稀釋法檢測(cè)鵝掌楸樹(shù)皮及葉片提取物抑菌作用，結(jié)果表明鵝掌楸樹(shù)皮和樹(shù)葉提取物對(duì)大腸埃希菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和糞鏈球菌有明顯抑菌效果。另有研究表明，鵝掌楸心材的醇提物以及番荔枝堿(anonaine)和鵝掌楸堿(liriodenine)等對(duì)多種細(xì)菌具有抑制作用[22-23]。

本試驗(yàn)通過(guò)雜種鵝掌楸葉各系統(tǒng)提取物的抗菌作用研究，發(fā)現(xiàn)雜種鵝掌楸葉提取物對(duì)沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌有不同程度的抗菌作用，其中氯仿部位提取物作用最強(qiáng)，對(duì)沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌有強(qiáng)抗菌作用，說(shuō)明其抗菌活性成分屬于極性較小的化合物；石油醚和乙酸乙酯部位提取物對(duì)沙門菌、乙酸乙酯部位提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有中等抑菌作用，說(shuō)明石油醚和乙酸乙酯部位也含有抗菌活性成分。對(duì)于試驗(yàn)中出現(xiàn)抑菌圈與MIC結(jié)果不一致的原因，分析可能是因?yàn)樗幬锝?jīng)稀釋后，抑菌效果有些減弱的快，有些減弱的慢，另外發(fā)揮抑菌作用的化學(xué)成分在結(jié)構(gòu)上也不相同，導(dǎo)致在肉湯或瓊脂中擴(kuò)散速度不同，在后續(xù)研究中，將對(duì)氯仿活性部位進(jìn)行分離純化，以期為雜種鵝掌楸葉抗菌成分的研究及應(yīng)用提供參考依據(jù)。