吾力江，道爾加拉，郝蘊(yùn)偉，剛特穆?tīng)?，馬鈺，巴音查汗*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.蒙古國(guó)科布多大學(xué)，科布多，布音特 84000)

犬新孢子蟲(chóng)(Neosporacaninum)是導(dǎo)致牛流產(chǎn)、死產(chǎn)的主要原因之一，在牛群養(yǎng)殖業(yè)中引起嚴(yán)重的疾病和經(jīng)濟(jì)損失[1]。每年因新孢子蟲(chóng)引起牛流產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)12.983億美元，最高可達(dá)到 23.80億美元，其中 2/3 的損失由乳制品行業(yè)產(chǎn)生，約為 8.429億美元[2-3]。新孢子蟲(chóng)的感染在很多國(guó)家都有報(bào)道，然而在蒙古國(guó)從未報(bào)道。2010年，玄學(xué)南等[4]報(bào)道過(guò)蒙古羊弓形蟲(chóng)的ELISA檢測(cè)，并未報(bào)道檢出新孢子蟲(chóng)。蒙古國(guó)科布多省與新疆青河接壤，兩國(guó)之間密切的貿(mào)易往來(lái)也可能是導(dǎo)致疾病傳播的原因之一。據(jù)了解，科布多省母畜流產(chǎn)率呈上升趨勢(shì)。為調(diào)查科布多省母畜流產(chǎn)是否與新孢子蟲(chóng)的感染有關(guān)，對(duì)新孢子蟲(chóng)病確診及確定病原種類尤為重要。中國(guó)新疆與蒙古國(guó)科布多省在“一帶一路”和“上合組織成員國(guó)家”長(zhǎng)期穩(wěn)定的合作關(guān)系的背景下，中國(guó)新疆將草食家畜流產(chǎn)癥防控實(shí)踐中成功、成熟的相關(guān)技術(shù)推廣到蒙古國(guó)西部省區(qū)草食家畜“母畜流產(chǎn)癥”上。因此，本研究采用PCR診斷方法，對(duì)科布多省部分試驗(yàn)點(diǎn)牛群進(jìn)行新孢子蟲(chóng)的初步檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

2019年1～4月，先后在科布多省2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分階段蹲點(diǎn)采集，在布音特蘇木鄉(xiāng)、艾爾登特蘇木鄉(xiāng)、明戈特蘇木牧場(chǎng)等3個(gè)檢測(cè)點(diǎn)共采集120份牛血樣；所有牛血樣均在EDTA抗凝管中采集，樣品被送往寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室，并在-20 ℃下儲(chǔ)存直到分析。

1.2 試劑與主要儀器

賽百盛樹(shù)脂型TM基因組DNA提純?cè)噭┖匈?gòu)自鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司，2×TaqPCR Green Mix、DL2000Marker、pMD18-T載體均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 引物合成

在生工生物技術(shù)(上海)有限公司合成了《新孢子蟲(chóng)檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/P 3499-2013)中規(guī)定的NC-5基因引物，具體反應(yīng)條件和引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物及反應(yīng)條件

引物序列片段大小(bp)退火溫度(℃)循環(huán)條件SN/T 3499FSN/T3499RGGGTGAACCGAGGGAATTCGCCAGTCAACCTACG2315895 ℃/30 s,58 ℃/30 s,72 ℃/30 s,30個(gè)循環(huán)

1.4 血液基因組DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

用賽百盛樹(shù)脂型TM基因組 DNA提純?cè)噭┖刑崛∨Ｈ?DNA，放置于-20 ℃冰箱。以提取的DNA為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系 50 μL：2×EsTaqMaster Mix 25 μL，上、下游引物各 2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。用膠回收試劑盒回收純化PCR 產(chǎn)物，連接pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化到 DH5ɑ 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含氨芐青霉素(100 mg/L)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。次日挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒；委托生工生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上經(jīng)BLAST比對(duì)確定產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果，MEGA 6.0軟件做多重比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。計(jì)算序列間的相似度。從GenBank中下載相關(guān)序列(表2)，以Eimeriatenella為外類群，用鄰近法構(gòu)建NJ樹(shù)[5]。

表2 來(lái)自Genbank的相關(guān)基因序列

種名宿主來(lái)源登錄號(hào)序列長(zhǎng)度/bp洪氏新孢子蟲(chóng)(N.hughesi)馬美國(guó)CF937166.1531美國(guó)CB831689.1636美國(guó)CB831693.1484美國(guó)CB831816.1620美國(guó)CB831888.1373美國(guó)CD667672.1424美國(guó)CF350036.1510美國(guó)CF937166.1531犬新孢子蟲(chóng)(N.caninum)奶牛波蘭EF463098.1336奶牛新西蘭AY459289.1350裸鼠瑞士X84238.11205兔英國(guó)EU686398.1227綿羊英國(guó)DQ077663.1227柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria tenella)雞美國(guó)BI895222.1477

2 結(jié)果

2.1 新孢子蟲(chóng)NC-5基因PCR擴(kuò)增

對(duì)所提取的120份牛血樣DNA 進(jìn)行了PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳30 min后，得到231 bp的特異性目的片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。120份樣品中，9份呈陽(yáng)性，總感染率為7.5%(9/120)；布因特蘇木鄉(xiāng)感染率為2.8%(1/35)；明戈特蘇木牧場(chǎng)感染率為3.3%(1/30)；艾爾登特蘇木鄉(xiāng)感染率為12.7%(7/55)，在3個(gè)檢測(cè)點(diǎn)里感染率最高。

2.2 序列分析

PCR擴(kuò)增牛血樣DNA，NC-5序列長(zhǎng)度為231 bp，與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度相符。經(jīng)測(cè)序和DNAMAN比對(duì)，去除兩端部分可變堿基后，獲得了226個(gè)堿基；本試驗(yàn)所得到的新孢子蟲(chóng)序列(N.caninumWLJ)與新孢子蟲(chóng)(GenBank登錄號(hào)：EF463098.1、AY459289.1、X84238.1、EU686398.1、DQ077663.1)的序列堿基相似度高達(dá)99.05%(圖2)。

注：M.DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.被檢樣品；2.陰性對(duì)照

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

注：深藍(lán)代表堿基全部相同、淺藍(lán)代表堿基1/2相同，紅色代表堿基3/4相同。

圖2 NC-5序列同源性比較

2.3 新孢子蟲(chóng)NC-5 基因系統(tǒng)發(fā)育分析

基于NC-5序列的NJ樹(shù)(圖3)顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中新孢子蟲(chóng)屬分為兩大支，其中，N.hughesi單獨(dú)聚為一支，N.caninum聚為一支，置信度為91%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，NC-5與GenBank 上下載的EU686398.1 構(gòu)成一個(gè)自展值為99% 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分支。

3 討論

科布多省位于蒙古西南邊疆，東面與扎布汗省和戈壁阿爾泰省相接，北面與烏布蘇省相連，西面與巴彥烏列蓋省為鄰，南面和西南面同我國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)接壤。新疆是連通歐亞大陸的重要樞紐，是第二座“亞歐大陸橋”的必經(jīng)之地，是與“一帶一路”沿線國(guó)家進(jìn)行貿(mào)易往來(lái)的重要門戶。蒙古國(guó)科布多省與中國(guó)新疆接壤，據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蒙古國(guó)與中國(guó)新疆接壤處常常有母畜流產(chǎn)發(fā)生。歐洲[7]、亞洲[8]、蒙古國(guó)以南的俄羅斯報(bào)道了衣原體導(dǎo)致的山羊流產(chǎn)[9]，而蒙古國(guó)以北的中國(guó)新疆報(bào)道了新孢子蟲(chóng)導(dǎo)致的牛羊流產(chǎn)情況[10-11]。蒙古國(guó)對(duì)新孢子蟲(chóng)病的研究仍處于空白。蒙古國(guó)是畜牧業(yè)大國(guó)，代代以草原畜牧業(yè)為主，依靠草原畜牧業(yè)提供的肉、乳等畜產(chǎn)品；蒙古國(guó)的牛群飼養(yǎng)量約為488.28萬(wàn)頭，位居綿羊數(shù)量之后第二位，牛群出現(xiàn)頻繁流產(chǎn)導(dǎo)致養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟(jì)迅速下降。因此，本研究通過(guò)新孢子蟲(chóng)病的PCR檢測(cè)，探究科布多省牛群流產(chǎn)是否與新孢子蟲(chóng)的感染有關(guān)。

圖3 基于NC-5基因序列構(gòu)建的鄰接法(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

采用PCR方法，針對(duì)新孢子蟲(chóng)NC-5基因檢測(cè)對(duì)血液、腦組織內(nèi)蟲(chóng)體敏感性較好，故作為本試驗(yàn)的診斷引物。本試驗(yàn)對(duì)隨機(jī)采集的120份牛血DNA進(jìn)行新孢子蟲(chóng)的PCR檢測(cè)，新孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率為7.5%(9/120)，確定了牛群中新孢子蟲(chóng)的存在。經(jīng)測(cè)序，科布多省牛新孢子蟲(chóng)NC-5株與GenBank上的英國(guó)株、瑞士株、新西蘭株同源性達(dá)99%，其序列相似性為95.13%，有個(gè)別堿基的差異，因此推測(cè)它們之間存在一定的進(jìn)化關(guān)系。

蒙古國(guó)科布多省牛群以散養(yǎng)為主，牧民家里飼養(yǎng)牧羊犬，這可能是導(dǎo)致新孢子蟲(chóng)感染牛群的原因。因此減少病原體傳播是防控牛流產(chǎn)的最有效的方法之一。

本文初次報(bào)道科布多省牛群感染新孢子蟲(chóng)，填補(bǔ)了蒙古國(guó)新孢子蟲(chóng)研究的空白，為后續(xù)新孢子蟲(chóng)病的防控研究提供了基礎(chǔ)資料。