馬春峰，郭振東，周靚

(1. 吉林大學(xué)人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062；2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130122；3. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

布魯菌是一種重要的人獸共患病病原體。它是一種需氧不運(yùn)動(dòng)、無莢膜的革蘭陰性球桿菌，細(xì)胞內(nèi)寄生，可以引起包括牛、豬、羊和犬等多種動(dòng)物流產(chǎn)[1]。有4種類型的布魯菌可以感染人并引起人類疾病，包括羊種布魯菌(B.melitensis)，牛種布魯菌(B.abortus)，豬種布魯菌(B.suis)和犬種布魯菌(B.canis)。其中以羊種布魯菌對(duì)人體的感染性最強(qiáng)，致病率最高，危害最為嚴(yán)重。布魯菌的毒力因子是細(xì)胞壁脂多糖，具有光滑型脂多糖的布魯菌毒力更強(qiáng)。布魯菌病主要損害人、畜的生殖系統(tǒng)和關(guān)節(jié)，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展以及人類健康產(chǎn)生較大的危害[2]。布魯菌病通常是一種職業(yè)病，主要感染經(jīng)常接觸受感染動(dòng)物或受污染動(dòng)物組織的人群，如農(nóng)民、臨床獸醫(yī)師和屠宰工人等，消費(fèi)者通過食用未經(jīng)高溫消毒的奶制品也有零星感染的案例[3]。另外一個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)感染群體就是實(shí)驗(yàn)人員，實(shí)驗(yàn)人員常常因?qū)嶒?yàn)過程中產(chǎn)生的生物氣溶膠而暴露感染[4]。本文綜述了布魯菌基本生物學(xué)特征、經(jīng)空氣感染的能力及感染后臨床表現(xiàn)，分析了實(shí)驗(yàn)室感染案例的主要原因，并提出了相應(yīng)的管理措施，以期為布魯菌實(shí)驗(yàn)室安全管理提供理論依據(jù)和借鑒參考。

1 布魯菌與生物恐怖主義

布魯菌是生物安全三級(jí)病原體，也是一種潛在的生物恐怖劑。其極易感染人，半數(shù)感染劑量小，感染途徑多，例如通過呼吸道黏膜、眼結(jié)膜、腸道或破損的皮膚均可感染，也有極少的案例通過器官移植、性接觸、母乳喂養(yǎng)或經(jīng)胎盤感染。布魯菌感染人后可引起持續(xù)的疾病和后遺癥，很難從體內(nèi)清除，被美國疾病預(yù)防控制中心列為B類病原體[5]。高溫和大多數(shù)消毒劑均可以殺滅布魯菌，但在特殊環(huán)境下布魯菌甚至可以存活2年，對(duì)人和動(dòng)物構(gòu)成持續(xù)威脅。1954年，布魯菌成為美軍武器化的第一個(gè)病原體，隨后包括英國在內(nèi)的多個(gè)國家也將布魯菌武器化。布魯菌恐怖劑屬于失能劑，感染后潛伏期長(zhǎng)、致死率低，但發(fā)病率高，給感染者帶來持續(xù)的病痛。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，布魯菌病可以治愈，且隨著新的更強(qiáng)有力的生物恐怖劑的不斷出現(xiàn)，雖然目前布魯菌仍在世界衛(wèi)生組織WHO的生物恐怖劑清單中，但已經(jīng)幾乎不被考慮了。

2 布魯菌感染臨床病理表現(xiàn)

布魯菌侵入機(jī)體后，首先迅速被多形核和單核巨噬細(xì)胞吞噬，但其能通過抑制吞噬體-溶酶體融合而躲避巨噬細(xì)胞殺傷效應(yīng)，并在巨噬細(xì)胞中復(fù)制。布魯菌的潛伏期非常不固定，短則1～3 d，長(zhǎng)則60 d甚至數(shù)月，平均1～2個(gè)月。潛伏期后，機(jī)體出現(xiàn)類似于流感病毒的非特異性癥狀。發(fā)熱是最典型，也是最普遍的癥狀(90%～95%)，持續(xù)性發(fā)熱、間歇性發(fā)熱或不規(guī)律發(fā)熱均有可能。同時(shí)，可能伴有虛弱、盜汗(40%～90%)、寒栗、全身或局部關(guān)節(jié)痛(20%～40%)、萎靡(80%～95%)、體重減輕或全身疼痛(40%～70%)等。

在疾病早期，患者常常出現(xiàn)菌血癥，在血液樣品中可以分離檢測(cè)到布魯菌。布魯菌隨著血液循環(huán)定殖于全身多個(gè)組織器官，特別是網(wǎng)狀內(nèi)皮組織，如肝、脾和骨髓造血系統(tǒng)等，進(jìn)而引起一系列局部疾病。人感染后的臨床表現(xiàn)多種多樣，70%的患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(如頭痛、沮喪和易怒等)和腸道系統(tǒng)癥狀(如厭食、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉或便秘)。羊種布魯菌感染的病例偶爾還會(huì)出現(xiàn)回腸炎、結(jié)腸炎或腹膜炎。大多數(shù)病例還會(huì)出現(xiàn)肝功酶升高，偶見肝膿腫和急性膽囊炎。15%～25%的病例出現(xiàn)咳嗽、胸痛等癥狀，但胸部X射線片無法發(fā)現(xiàn)異常，偶見肺膿腫、結(jié)節(jié)和胸膜滲出。10%～20%的病例出現(xiàn)淋巴結(jié)病變，20%～70%的病例出現(xiàn)脾腫大，10%～30%出現(xiàn)肝腫大。皮膚的臨床表現(xiàn)可能包含潰瘍、瘀點(diǎn)、紫癜和結(jié)節(jié)性紅斑。布魯菌病的骨關(guān)節(jié)并發(fā)癥也很常見(40%)，包括關(guān)節(jié)炎、黏液囊炎、骨髓炎或脊椎炎等。其他并發(fā)癥如附睪炎、腦膜炎、腦炎、癲癇和神經(jīng)病等則很少出現(xiàn)(<2%)。心血管并發(fā)癥包括心肌炎、心包炎和動(dòng)脈瘤。血液異常包括貧血、嗜中性白血球減少和血小板減少[6]。在很多臨床樣本中均可以分離到布魯菌，如膿液、血液、骨髓、關(guān)節(jié)滑液和組織等，極少情況下也可以在腦脊液、尿液、生殖分泌液中分離到細(xì)菌。布魯菌感染者即使不加治療，致死率也是極低的(<2%)。幾乎所有患者均可采用抗生素治療法，治愈復(fù)發(fā)率小于10%。

3 布魯菌經(jīng)空氣感染與傳播能力

布魯菌極易氣溶膠化，很多未知源頭的實(shí)驗(yàn)室感染案例均指向氣溶膠[7-10]。曾有一家擁有129名員工的大型屠宰場(chǎng)暴發(fā)布魯菌病，在其環(huán)境空氣樣本中便可分離到布魯菌[11]。氣溶膠化后危害極大，無色無味，感染于無形之中，載有病原體的氣溶膠微粒可隨風(fēng)播散至遠(yuǎn)處，短時(shí)間內(nèi)造成大面積感染[8,10]。呼吸道是布魯菌感染的一種重要途徑，研究表明，人體通過氣溶膠途徑吸入10-100個(gè)細(xì)菌便足以構(gòu)成感染[12]。有學(xué)者采用豚鼠模型證實(shí)布魯菌經(jīng)氣溶膠途徑比經(jīng)消化道途徑更加易感[13-14]。但氣溶膠途徑感染后，患者的臨床表現(xiàn)與經(jīng)其他途徑感染并無顯著差異[12]。

布魯菌在人與人之間的傳播很少發(fā)生，僅有極個(gè)別案例發(fā)生在血液暴露、感染組織暴露和性接觸的情況下[12]。付瑩瑩[15]開展了BALB/c小鼠間的直接接觸傳播試驗(yàn)，將24只感染的雌性小鼠與24只健康雌性小鼠同籠飼養(yǎng)15 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在一只健康小鼠體內(nèi)分離到布魯菌，說明布魯菌可以在小鼠間經(jīng)直接接觸傳播，但傳播效率較低，為1/24 (4.2%)。

4 布魯菌病的診斷

分離培養(yǎng)布魯菌是布魯菌病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[16]。然而，血培養(yǎng)結(jié)果常常不太穩(wěn)定[17]，不同種屬的布魯菌生長(zhǎng)狀況存在差異。骨髓培養(yǎng)結(jié)果雖然更為穩(wěn)定[18]，但需要經(jīng)歷痛苦的機(jī)體侵入性取樣過程。而且，培養(yǎng)鑒定周期需要耗時(shí)3～42 d不等，不適合做早期快速診斷。因此，急需尋找新的診斷方法。

免疫學(xué)檢測(cè)是非常有效的方法，常用的有兩種，一是基于識(shí)別表面抗原的血清凝集試驗(yàn)，二是基于識(shí)別抗原/抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。兩種方法敏感性和特異性均高于85%。血清凝集試驗(yàn)的局限性是在一些特殊情況下，如血清轉(zhuǎn)化滯后、出現(xiàn)抑制性抗體或前帶現(xiàn)象，可能會(huì)導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。ELISA方法則更加快速、特異、敏感，已成為國際貿(mào)易中指定的診斷方法，可分為雙抗夾心法(常用于大分子抗原檢測(cè))、競(jìng)爭(zhēng)法(常用于小分子抗原檢測(cè))和間接法(常用于抗體檢測(cè))。一些學(xué)者還開發(fā)了基于膠體金或量子點(diǎn)的免疫層析快速診斷技術(shù)[19-20]，具有操作簡(jiǎn)單、無需復(fù)雜設(shè)備、快速便捷的優(yōu)點(diǎn)，非常適合流行病學(xué)調(diào)查和現(xiàn)場(chǎng)快速初篩。然而，由于抗體形成后并非長(zhǎng)期存在，因此免疫學(xué)檢測(cè)無法應(yīng)用于患者定期復(fù)查或者復(fù)發(fā)檢測(cè)中。

在分子診斷技術(shù)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是應(yīng)用最為廣泛的，具有快速(<1h)、極其敏感和特異的優(yōu)點(diǎn)。美軍采用該方法建立了包括布魯菌在內(nèi)的多種重要生物威脅病原體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)。同時(shí)，伴隨著核酸自動(dòng)提取技術(shù)、微流控技術(shù)和基因芯片技術(shù)[21]的興起，未來PCR技術(shù)完全可以實(shí)現(xiàn)無人高通量智能檢測(cè)[22]。

5 布魯菌實(shí)驗(yàn)室感染事件

在現(xiàn)代化城市里，公共衛(wèi)生體系較為完善，奶制品強(qiáng)制進(jìn)行巴氏消毒，動(dòng)物檢疫也較為嚴(yán)格，因此布魯菌病是一種很少能接觸到的疾病。但在實(shí)驗(yàn)室感染事件中，布魯菌卻是常見的病原體，約2%的布魯菌感染病例來源于實(shí)驗(yàn)室感染[23-27]。1988年，美國一家微生物實(shí)驗(yàn)室8名實(shí)驗(yàn)人員莫名感染布魯菌，已排除人傳人、食源和水源感染的可能性，經(jīng)過一系列調(diào)查，最終發(fā)現(xiàn)與6周前解凍的一份病人樣本培養(yǎng)物并未在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng)有關(guān)，很可能是實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的生物氣溶膠被實(shí)驗(yàn)人員吸入所致[28]；1990年，意大利薩薩里大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室在轉(zhuǎn)移布魯菌樣本時(shí)，意外導(dǎo)致離心管破碎，導(dǎo)致12人感染[4]。2004年，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)土耳其一家醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室55名實(shí)驗(yàn)人員中有12名感染了布魯菌，經(jīng)調(diào)查分析估算出每名實(shí)驗(yàn)人員每年的感染概率為8%[29]。2010年，我國東北某大學(xué)采用未經(jīng)檢疫的山羊進(jìn)行教學(xué)實(shí)驗(yàn)，最終導(dǎo)致28名師生陸續(xù)確診感染布魯菌[30]；2019年，我國某生物藥廠在布魯菌疫苗生產(chǎn)過程中使用過期消毒劑，致使生產(chǎn)發(fā)酵罐廢氣排放滅菌不徹底，攜帶含菌發(fā)酵液的廢氣形成含菌氣溶膠，隨風(fēng)飄散，被人體吸入或黏膜接觸導(dǎo)致大量學(xué)生檢出抗體陽性[31]。

布魯菌實(shí)驗(yàn)室感染事件時(shí)有發(fā)生，分析總結(jié)實(shí)驗(yàn)室存在暴露風(fēng)險(xiǎn)的主要原因如圖1所示，具體為以下5點(diǎn)：1)實(shí)驗(yàn)人員不清楚樣本可能含有布魯菌，僅在普通實(shí)驗(yàn)環(huán)境下操作樣本[32]；2)實(shí)驗(yàn)人員培養(yǎng)出菌落后，不了解布魯菌菌落形態(tài)或者革蘭染色結(jié)果模棱兩可，當(dāng)成是一般病原進(jìn)行處理[33-34]；3)一些商業(yè)化生化檢測(cè)試劑盒如API20NE，可能將布魯菌誤檢為苯丙酮酸莫拉菌或苯丙酮酸冷桿菌[35]；4)未按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作。在布魯菌的常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作過程中，如懸液制備、離心、旋渦震蕩、傳代培養(yǎng)和生化試驗(yàn)，特別是過氧化氫酶試驗(yàn)，若不加注意，均有可能產(chǎn)生生物氣溶膠。特別是一些誤操作導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)室事故，如離心管破碎[4]、培養(yǎng)物跌落、逸灑[33]，造成的實(shí)驗(yàn)室暴露感染風(fēng)險(xiǎn)更大；5)實(shí)驗(yàn)室管理把關(guān)不嚴(yán)。如使用未經(jīng)檢疫或來源不明的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)設(shè)備未進(jìn)行定期檢修維護(hù)，消毒措施不當(dāng)導(dǎo)致消毒不徹底等。

圖1 布魯菌實(shí)驗(yàn)室暴露風(fēng)險(xiǎn)因素

6 布魯菌實(shí)驗(yàn)室管理措施

根據(jù)《人間傳染的病原微生物名錄》，布魯菌活菌操作及動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)需要在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，樣本檢測(cè)需要在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。由于缺乏系統(tǒng)性的評(píng)價(jià)體系，實(shí)驗(yàn)室的暴露風(fēng)險(xiǎn)是很難進(jìn)行定量的，僅能依靠案例教育和定期檢查降低風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)西班牙國家調(diào)查發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)與每年布魯菌相關(guān)的實(shí)驗(yàn)量有關(guān)，而且多數(shù)感染案例都是實(shí)驗(yàn)人員未遵守生物安全操作規(guī)范導(dǎo)致的[36]。

通過分析眾多實(shí)驗(yàn)室暴露感染案例，對(duì)預(yù)防實(shí)驗(yàn)室感染布魯菌提出如下建議：

1)很多實(shí)驗(yàn)人員對(duì)其操作病原感染后的表型癥狀并不了解，這是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室感染發(fā)生后無法及時(shí)發(fā)現(xiàn)的重要原因之一[37]，應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行定期培訓(xùn)，包括布魯菌的健康危害、感染途徑、傳播方式和感染后癥狀表現(xiàn)等，可通過簡(jiǎn)報(bào)宣傳、公眾號(hào)推文和專家講座等方式開展。

2)完善送樣人員與實(shí)驗(yàn)人員的溝通協(xié)調(diào)機(jī)制。送樣人員需告知樣本來源，對(duì)于具有潛在布魯菌陽性風(fēng)險(xiǎn)的樣品應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行警示強(qiáng)調(diào)，以便選擇合適的防護(hù)等級(jí)。

3)加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室安全管理，制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，并確保管理人員和實(shí)驗(yàn)人員嚴(yán)格執(zhí)行，開展實(shí)驗(yàn)安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，定期進(jìn)行自檢、抽檢[38]。

4)在處理所有革蘭氏陰性菌或難以確定革蘭氏染色結(jié)果的桿菌或球桿菌時(shí)，均需在生物安全柜中操作，除非已經(jīng)排除布魯菌[32]。

5)布魯菌培養(yǎng)器皿在不使用時(shí)應(yīng)該密封，妥善放置以確保安全，防止跌落逸灑。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，應(yīng)及時(shí)高壓滅菌。

6)當(dāng)檢測(cè)結(jié)果疑似為布魯菌時(shí)，分離物應(yīng)立即轉(zhuǎn)至生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步工作。

7)布魯菌的抗生素敏感性試驗(yàn)沒有意義，因?yàn)椴剪斁〉闹委熡忻鞔_的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程。不建議進(jìn)行藥敏試驗(yàn)或者其他非必要測(cè)試，特別是可產(chǎn)生氣溶膠的實(shí)驗(yàn)[8]。

8)如果在生物安全柜外發(fā)生意外逸灑，應(yīng)立即疏散實(shí)驗(yàn)室人員，關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室門，并由經(jīng)良好培訓(xùn)的且個(gè)人防護(hù)裝備穿戴齊全的人員消毒和凈化實(shí)驗(yàn)室[4]。

9)若實(shí)驗(yàn)人員出現(xiàn)不明原因發(fā)熱，應(yīng)立即進(jìn)行身體健康檢查，鑒定布魯菌感染的可能性。

10)一旦發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室感染，應(yīng)立即徹底調(diào)查事件情況，評(píng)估人員暴露風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)暴露人員進(jìn)行抗生素藥物預(yù)防。同時(shí)修訂完善標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，加強(qiáng)人員管理培訓(xùn)。

對(duì)于潛在接觸過布魯菌的實(shí)驗(yàn)人員做如下建議：

1)對(duì)于直接操作或處理過陽性培養(yǎng)物的人員，應(yīng)立即隔離，由職業(yè)醫(yī)師監(jiān)護(hù)觀察至少6個(gè)月。同時(shí)，這些人員要立即接受為期3周的預(yù)防性抗生素治療(口服強(qiáng)力霉素100 mg一天2次，利福平600 mg一天1次)[27]。研究表明，預(yù)防性抗生素治療可以極大降低潛在暴露感染者的發(fā)病幾率[4,27]。隨后應(yīng)進(jìn)行定期診斷檢查以確定是否發(fā)生布魯菌感染，前三個(gè)月的檢查可以每周1次或者每周2次，之后可以每月檢查1次。

2)對(duì)于未直接接觸過陽性培養(yǎng)物的其他人員，需采取本底血液樣本由職業(yè)健康部門存儲(chǔ)，在征得人員同意的情況下開展血液檢測(cè)；由于這類人員感染風(fēng)險(xiǎn)較小，不建議進(jìn)行預(yù)防性抗生素治療，除非某些人員特別擔(dān)心自己感染的可能性，在簽署同意書后可開展治療。

7 小結(jié)

布魯菌病是一種古老的、全球普遍存在的人獸共患傳染病，給人類健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重危害。全世界感染患者約有500萬-600萬人，每年新增患者約50萬人[39]。布魯菌極易氣溶膠化，經(jīng)呼吸道感染是其主要感染途徑之一，而實(shí)驗(yàn)室是樣本檢測(cè)和細(xì)菌分離培養(yǎng)的場(chǎng)所，實(shí)驗(yàn)操作極易產(chǎn)生氣溶膠而給實(shí)驗(yàn)人員帶來暴露感染風(fēng)險(xiǎn)。通過分析過往案例中的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，不斷制定完善預(yù)防控制措施，并確保管理人員及實(shí)驗(yàn)人員嚴(yán)格執(zhí)行，可以將風(fēng)險(xiǎn)降到最低[38]。本研究提出的部分實(shí)驗(yàn)室管理措施不僅對(duì)預(yù)防布魯菌，對(duì)于預(yù)防其他人獸共患病的實(shí)驗(yàn)室獲得性感染也同樣具有借鑒意義。