張文剛 姜 芹 孫冰清 張 妤 顧 欣

上海市動物疫病預防控制中心，上海201103

近2年來，由于非洲豬瘟的影響導致雞肉粉原料中摻假、摻雜豬肉粉現(xiàn)象頻發(fā)，不僅嚴重侵害了飼料生產(chǎn)廠家的利益，而且也給非洲豬瘟的防控帶來了很大安全隱患。為切實掌握飼料生產(chǎn)企業(yè)雞肉粉原料中豬源性成分的污染情況，本文對來自寵物食品生產(chǎn)企業(yè)、飼料檢測機構(gòu)、企業(yè)內(nèi)部質(zhì)量檢測機構(gòu)及第三方飼料檢測機構(gòu)提供的61 個產(chǎn)品進行了豬源性成分檢測分析。目前，現(xiàn)有的動物源性成分鑒別方法一般只是開展定性檢測，結(jié)果以陰性或陽性的形式報告，這類檢測結(jié)果無法區(qū)分是污染還是故意摻假所致，無法有效甄別是否存在摻假行為及其嚴重程度。因此，開展定量檢測技術(shù)研究來量化鑒別某一動物源性成分含量十分必要[1-3]。本研究通過在雞肉粉中添加不同比例的豬肉粉制作豬源性成分的含量標準曲線，通過標準曲線來確定樣品中豬源性成分含量，基本實現(xiàn)了豬源成分的量化鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檢測樣品來源于寵物食品生產(chǎn)企業(yè)、雞肉粉生產(chǎn)、銷售企業(yè)及檢測機構(gòu)；無水乙醇，國藥集團試劑有限公司；DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；豬源性檢測試劑盒，廣州維伯鑫生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Light Cycler 96 型實時熒光PCR 儀，瑞士Roche 公司；渦旋儀，德國Heidolph 公司；AB135-S/FACT 電子分析天平，梅特勒托利多儀器上海有限公司；離心機，美國Thermo Scientific 公司；Nanodrop 分光光度計，美國Thermo Scientific 公司。

1.3 方 法

1）樣品DNA 提取。本試驗中DNA 提取采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的組織基因組DNA 提取試劑盒。稱取約50 mg 試樣，裝入1.5 mL已滅菌的離心管中，然后按照試劑盒操作步驟進行NDA 提取，DNA 提取溶液于-20 ℃保存。在提取樣品DNA 的同時，對陽性對照和陰性對照進行同法操作。

2）標準曲線制備。本試驗以純雞肉粉為基質(zhì)，純豬肉粉為添加物質(zhì)，分別配制豬肉粉含量為10%、1%、0.1%的樣品，同時以純豬肉粉為含量100%、純雞肉粉為豬肉粉含量0，提取DNA 后進行定量檢測。試驗數(shù)據(jù)以lg（豬肉粉百分含量）為橫坐標，以對應(yīng)的Ct 值為縱坐標繪制檢測標準曲線。

3）添加回收試驗。以純雞肉粉為基質(zhì)，純豬肉粉為添加物質(zhì)，分別配制豬肉粉含量為50%、5%、0.5%的樣品，提取DNA 后進行定量檢測。每個濃度重復測3 次，每次2 個平行，考察方法的回收率及變異系數(shù)。

4）樣品檢測。本試驗以樣品DNA 提取液為模板，采用廣州維伯鑫生物科技股份有限公司提供的豬源性檢測試劑盒進行檢測，引物序列為F：CGACAAAGCAACCCTCACAC，R：TGCGAGGGCG-GTAATGAT；探針序列為CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，其中2×牛羊源性成分檢測反應(yīng)液12.5 μL、牛羊源性成分檢測引物混合液和牛羊源成分檢測探針混合液各1 μL、模板DNA（1～100 ng/μL）2 μL，滅菌雙蒸水補足體系用量使總體積為25 μL。檢測過程中分別設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。反應(yīng)條件為：預變性95 ℃10 s；變性95 ℃5 s,退火延伸60 ℃30 s（收集熒光信號），40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，利用儀器軟件處理分析擴增曲線并確定循環(huán)閾值（Ct 值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA 提取

為保證檢測結(jié)果的準確性，本研究對樣品中提取的DNA 進行質(zhì)量和濃度檢測，用核酸蛋白濃度檢測儀檢測所有樣品溶液的濃度，并稀釋至50 ng/μL 后使用，純度（D260nm/280nm）均在1.8～1.9 之間，表明提取的DNA 濃度和純度較好，可用于下一步試驗[4]。

2.2 標準曲線

按照純豬肉粉為100%、雞肉粉中豬肉粉含量為10%、1%、0.1%及純雞肉粉（豬肉粉含量0）的順序進行檢測分析，同時以Ct值為縱坐標，以lg（豬肉粉的百分含量）為橫坐標制作標準曲線（圖1）。本方法線性方程為y=-2.911x+21.68，R2=0.998，顯示出較好的線性關(guān)系。

2.3 回收率及變異系數(shù)

按照1.3 中3）進行添加回收試驗，考察方法的回收率。本試驗中豬肉粉的加標回收率為90.9%～108.7%，變異系數(shù)≤5.7%（表1）。

2.4 實樣檢測

本研究對從不同環(huán)節(jié)收集到的61 批雞肉粉樣品進行了豬源性成分檢測，其中檢出含有豬源性成分的樣品15 批，具體檢出情況見表2。

3 討 論

在目前的標準或文獻報道中，動物源性成分檢測使用的檢測方法多是定性檢測方法，這些方法不能對摻假的樣品進行定量分析，因此需要建立準確性高、操作性強且易于推廣的定量檢測方法以滿足行業(yè)管理需求。本研究通過在雞肉粉中添加不同比例的豬肉粉制作豬源性成分的含量標準曲線，通過標準曲線來確定樣品中豬源性成分含量，進而判斷雞肉粉原料是否故意摻假并衡量其摻假程度。試驗結(jié)果顯示，本方法中豬源性成分的檢測限達到了0.1%（g/g），豬源性成分在0.1%～100%含量范圍內(nèi)，標準曲線線性關(guān)系良好（R2達到0.99 以上），模擬混合樣品及實樣檢測均顯示該方法準確度高、穩(wěn)定性好。

圖1 豬肉粉添加回收標準曲線

表1 血常規(guī)檢測結(jié)果

表2 雞肉粉中豬源性檢測陽性結(jié)果

本文通過對市場上收集到的61 批雞肉粉進行篩查檢測，初步掌握了雞肉粉中豬源性成分的含量及其污染情況。檢測樣品從抽樣環(huán)節(jié)上分，來源涵蓋了飼料檢測機構(gòu)、雞肉粉、經(jīng)營和使用企業(yè)（寵物飼料生產(chǎn)企業(yè)）等各個環(huán)節(jié)；從產(chǎn)地上分，樣品包含了國內(nèi)產(chǎn)品和進口產(chǎn)品兩類，其中進口產(chǎn)品6 批，國產(chǎn)樣品55 批，分別來自廣東、山東、四川、上海、湖北等地。在檢測的61 批雞肉粉樣品中，檢出含有豬源性成分的樣品15 批，總體檢出率為24.6%，其中含量超過10%的樣品有4 批，占6.55%，含量最高的甚至達到了純豬肉粉的程度；含量在0.5%～10%之間的有7 批，占11.5%；檢出但含量小于0.5%的有4 批，占6.55%；未檢出豬源性成分的有46 批，占75.4%?？傮w上來說，市場上雞肉粉中豬源性成分的檢出率較高，應(yīng)當加強對雞肉粉原料中豬源性成分的檢測和監(jiān)管。