趙 慧,張峰波,朱玥潔,龐楠楠,安夢婷,李 斌,馬秀敏,丁劍冰，

細(xì)粒棘球蚴病又稱囊性包蟲病(cystic echinococcosis，CE)，是由細(xì)粒棘球絳蟲所致的最為常見的人獸共患病，是新疆、青海、西藏等農(nóng)牧地區(qū)的高發(fā)疾病[1]。雖大部分CE患者可通過手術(shù)和藥物進(jìn)行治療，但依舊存在術(shù)后復(fù)發(fā)、藥物耐受和部分不良反應(yīng)等問題，治療效果不理想[2-5]。共刺激分子程序性死亡受體 1(programmed death 1，PD-1)是近年發(fā)現(xiàn)的免疫抑制分子，因在免疫耐受中發(fā)揮重要作用而被人們逐漸重視[6]。研究發(fā)現(xiàn)PD-1參與抑制調(diào)節(jié)T細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的功能，且在腫瘤和病毒感染等疾病中通過抑制效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮作用，從而促進(jìn)疾病的發(fā)展[7-9]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg或Tr)是一群能識別靶細(xì)胞MHC分子所提呈的TCR-抗原肽，并發(fā)揮一定免疫抑制功能的T細(xì)胞。通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化增殖達(dá)到機體的免疫耐受和預(yù)防自身免疫性疾病的作用。這類細(xì)胞以表達(dá)Foxp3、CD25、CD4為細(xì)胞表型特征，通過分泌具有抑制作用的細(xì)胞因子TGF-β和IL-10發(fā)揮其功能[10-13]。在過去20年內(nèi)，研究已經(jīng)證實了Treg細(xì)胞在感染、腫瘤、器官移植、同種異體胎兒免疫相關(guān)疾病方面具有抑制各種途徑的病理生理免疫應(yīng)答的作用[14]。然而，Treg細(xì)胞的抑制作用也同時促進(jìn)了感染、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展[15]。

本研究欲采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測CE患者外周血中Treg細(xì)胞上PD-1的表達(dá)，通過熒光定量RT-PCR(QRT-PCR)法檢測CE患者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中PD-1 mRNA和Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA的表達(dá)，用ELISA法檢測CE患者血清中Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β和IL-10的水平，進(jìn)一步探討負(fù)性共刺激分子PD-1與Treg細(xì)胞在該疾病中的關(guān)系和作用。

1 材料與方法

1.1研究對象 本研究涉及的所有實驗內(nèi)容均征得CE患者和對照人群的知情同意，研究已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。研究對象由CE患者和對照人群組成。CE患者30例，為2017年1月至2017年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化血管外科中心肝膽包蟲外科住院的確診患者(根據(jù)B超分型，均為活動性CE1-CE3患者)，其中男性18例，女性12例，平均年齡44±13.42歲。CE患者經(jīng)臨床表現(xiàn)及體征、免疫學(xué)檢查、B超和CT檢查進(jìn)行確診，所有患者均為初次手術(shù)，且無慢性感染病、先天性肝囊腫、膽囊積液等其他肝膽系統(tǒng)疾?。粚φ战M30例為體檢人群，其中男性16例，女性14例，平均年齡41±10.21歲，均排除慢性感染、右側(cè)腎盂積水、細(xì)菌性肝膿腫、先天性肝囊腫、膽囊積液、先天性膽總管囊型擴(kuò)張癥等肝膽系統(tǒng)疾病及其他重大疾病。

1.1.1標(biāo)本采集 30例CE患者和30例對照人群均空腹8 h后采集EDTA抗凝血5 mL和不抗凝血3 mL。EDTA抗凝血為FCM檢測和QRT-PCR檢測用。不抗凝血經(jīng)3 000 r/min 離心5 min(德國eppendorf -5415R)，吸取血清于EP管中，-20 ℃凍存待ELISA檢測用。

1.2 方 法

1.2.1FCM法檢測外周血PD-1+CD4+CD25+Treg細(xì)胞的百分比 將30例CE患者和30例對照人群的外周血放置于流式管中，裂解紅細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，用臺盼藍(lán)染色計活細(xì)胞數(shù)>95%，分別加入流式抗體(美國BD公司)CD3-APC 2 μL、CD4-Percp 2 μL、PD-1-PE 2 μL、CD25-Pecy7 2 μL，室溫避光孵育20 min后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106/mL，用流式細(xì)胞儀(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)檢測。

1.2.2QRT-RCP法檢測外周血PBMCs中PD-1 mRNA和Foxp3 mRNA的含量。

1.2.2.1設(shè)計引物 從GenBank獲取人PD-1和Foxp3基因全序列，用VectorNTIsulte7.0軟件包對獲取的人的各基因序列進(jìn)行比對分析，選取相對保守、同源性高的區(qū)域應(yīng)用Primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計，以β-actin作內(nèi)參照(表1)。

表1 PD-1、Foxp3和β-actin基因引物序列Tab.1 Gene primers sequence of PD-1、Foxp3and β-actin

1.2.2.2人全血DNA的提取 所有用品均嚴(yán)格按消除RNase的常規(guī)方法處理，玻璃及金屬器皿在250 ℃烘烤4 h，塑料器皿用DEPC溶液浸泡24 h，高壓滅活DEPC后烤干備用。采集CE患者和對照人群外周血，分離外周血PBMCs并保存于液氮中作進(jìn)一步分析。用Trizol-LS試劑(Invitrogen，Life Technologies，美國)從PBMCs中提取總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，美國)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。提取的cDNA用Smartspec3000型紫外分光光度計測定濃度和純度。

1.2.2.3目的基因檢測 采用SYBR-GREEN-PCR預(yù)混料(中國大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司)按照制造商的方案進(jìn)行QRT-PCR(美國BIO-RAD公司)。擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因β-actin。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min(UDG孵育)，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。用2-ΔCt對靶基因進(jìn)行Ct值量化。重復(fù)實驗至少3次。

1.2.3ELISA法檢測血清中TGF-β和IL-10的水平 檢測CE患者和對照人群血清中TGF-β和IL-10的水平。檢測按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)450 nm處讀吸光度(OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。

2 結(jié) 果

2.1CE患者和對照人群中PD-1+CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá) 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CE患者和對照人群中PD-1+CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá)分別為(34.03±5.97)%和(12.82±3.92)%；與對照人群相比，CE患者PD-1+CD4+CD25+Treg細(xì)胞(P=0.000)的表達(dá)均增高(圖1)。

注：①P<0.001圖1 外周血中PD-1+CD4+CD25+ Treg細(xì)胞的比例Fig.1 Ratio of PD-1+CD4+CD25+ Treg cells in peripheral blood

2.2CE患者和對照人群中PD-1和Foxp3 mRNA含量的表達(dá) 通過熒光定量PCR檢測CE患者和對照人群中PD-1 mRNA含量的表達(dá)分別為4.79±0.95和1.03±0.4； Foxp3 mRNA含量的表達(dá)分別為17.92±2.66和8.36±2.29。與對照人群相比，CE患者中PD-1(t=18.35，P=0.000)和Foxp3 mRNA(t=14.89，P=0.000)含量均顯著增高(P<0.01)(圖2)。

注：①P<0.001圖2 外周血單個核細(xì)胞中PD-1和Foxp3 mRNA含量的表達(dá)Fig.2 The mRNA expression of PD-1 and Foxp3in peripheral blood mononuclear cells

2.3CE患者和對照人群中TGF-β和IL-10水平的表達(dá) 通過ELISA法檢測CE患者和對照人群血清中TGF-β水平的表達(dá)分別為15.10±2.35和9.76±1.53；IL-10水平的表達(dá)分別為19.81±3.36和10.02±2.31。與對照人群相比，CE患者TGF-β(t=10.43，P=0.046)和IL-10(t=13.13，P=0.000)水平的表達(dá)均增加(P<0.05)(圖3)。

注：a)The levels of TGF-β in sera; b) The levels of IL-10 in sera圖3 血清中TGF-β 和 IL-10水平的表達(dá)Fig.3 Levels of TGF-β and IL-10 in sera

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1CE患者外周血中PD-1和Foxp3 mRNA含量的表達(dá)的相關(guān)性 通過Pearson法分析CE患者外周血中PD-1mRNA及Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達(dá)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，CE患者外周血PD-1 mRNA的表達(dá)均與Foxp3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.602，P<0.01)(圖4)。

2.4.2CE患者外周血中PD-1+CD4+CD25+Treg細(xì)胞與血清中TGF-β和IL-10水平的相關(guān)性 通過Pearson法分析CE患者外周血中PD-1+CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá)及血清中TGF-β和IL-10的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，CE患者外周血中PD-1+CD4+CD25+Treg細(xì)胞與TGF-β(r=0.477，P<0.01)和 IL-10(r=0.825，P<0.01)的水平均呈正相關(guān)(圖5)。

圖4 PD-1 mRNA與Foxp3mRNA的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of PD-1 mRNA and Foxp3 mRNA

注：a) The correlation analysis between PD-1+CD4+CD25+Treg cells and TGF-β; b) The correlation analysis between PD-1+CD4+CD25+Treg cells and IL-10圖5 外周血中PD-1+CD4+CD25+Treg細(xì)胞和TGF-β、IL-10水平的表達(dá)的相關(guān)性Fig.5 Correlation analysis of PD-1+CD4+CD25+Treg cells and TGF-β、IL-10

3 討 論

細(xì)粒棘球蚴感染會逐漸形成慢性感染，傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)清除和藥物治療都難以有效根除感染。前期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴病不斷發(fā)展成為慢性化感染的一個主要原因是機體細(xì)胞免疫功能紊亂，導(dǎo)致免疫失衡現(xiàn)象明顯，表現(xiàn)為機體不能有效清除病原體，且向有利于細(xì)粒棘球蚴感染的方向發(fā)展[16]。臨床試驗和動物實驗結(jié)果均顯示，人和小鼠感染棘球蚴后體內(nèi)CD4+T細(xì)胞起到了主要免疫調(diào)節(jié)作用，不同輔助性T細(xì)胞亞群發(fā)揮了各自的功能。其中有以Th1和Th17細(xì)胞為主的抗感染免疫，也有以Th2細(xì)胞為主的抑制性免疫[17-19]。本研究結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞中一組重要亞群Treg細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴感染中也發(fā)揮了重要作用，且可能與負(fù)性共刺激分子PD-1的高表達(dá)相關(guān)。

目前普遍認(rèn)為Treg細(xì)胞可通過分泌具有抑制作用的細(xì)胞因子TGF-β和IL-10發(fā)揮功能[20]。本研究結(jié)果顯示在CE患者中，Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3水平明顯升高，同時相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β和IL-10的水平也顯著增高，這均說明在CE患者中Treg細(xì)胞發(fā)揮了作用。正常機體內(nèi)Treg細(xì)胞的存在是為了抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化增殖達(dá)到機體的免疫耐受和預(yù)防自身免疫性疾病的發(fā)生。一旦發(fā)生感染、腫瘤等疾病，機體會產(chǎn)生大量效應(yīng)T細(xì)胞通過分泌炎性因子等對病原體進(jìn)行清除[21]。與此同時，Treg細(xì)胞也會相應(yīng)大量增殖，控制炎性因子等對機體的病理損害。然而這種關(guān)系一旦發(fā)生失衡，Treg細(xì)胞的抑制作用會不利于疾病的控制，并促進(jìn)感染的發(fā)展[22]。因此，推測Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子的免疫抑制作用使細(xì)粒棘球蚴發(fā)生免疫逃避，從而促進(jìn)感染的持續(xù)性發(fā)展，甚至可能與術(shù)后感染復(fù)發(fā)和藥物耐藥有關(guān)。

另本研究發(fā)現(xiàn)CE患者外周血中PD-1在Treg細(xì)胞表面的表達(dá)顯著增加。研究發(fā)現(xiàn)PD-1/ PD-L1通路可通過TGF-β誘導(dǎo)人外周血T淋巴細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[23]。另PD-1的高表達(dá)與腫瘤浸潤性Treg細(xì)胞的增加和效應(yīng)T細(xì)胞的減少有關(guān)，阻斷PD-1可有效增強抗腫瘤免疫[24]。本研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞上PD-1的表達(dá)與其特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β和IL-10均呈正相關(guān)，由此考慮在CE患者中PD-1對Treg細(xì)胞的生成起誘導(dǎo)促進(jìn)作用。推測其通過促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)，促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)TGF-β和IL-10的分泌。研究認(rèn)為活化的Treg細(xì)胞表達(dá)PD-1，并且有可能通過PD-1/ PD-L1途徑發(fā)揮效應(yīng)機制。用PD-L1抗體封閉PD-1/ PD-L1通路可阻斷Treg細(xì)胞的抑制功能，恢復(fù)效應(yīng)T細(xì)胞的增殖[25]。因此CE患者中Treg細(xì)胞表面PD-1表達(dá)的增加提示負(fù)性共刺激分子PD-1與該疾病有關(guān)，且參與細(xì)粒棘球蚴感染中Treg細(xì)胞介導(dǎo)的抑制性免疫。另PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后，可使效應(yīng)T細(xì)胞功能受損[9,27]，故推測PD-1可協(xié)同Treg細(xì)胞增強該疾病的免疫逃避作用，加重感染進(jìn)程和慢性化的發(fā)展。

綜合分析，本研究考慮CE患者中負(fù)性共刺激分子PD-1的表達(dá)與Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β和IL-10相關(guān)。Treg細(xì)胞上PD-1的高表達(dá)會促進(jìn)Treg細(xì)胞的生成及細(xì)胞因子TGF-β和IL-10的產(chǎn)生，且PD-1與Treg細(xì)胞共同參與細(xì)粒棘球蚴感染的免疫逃避過程，從而促進(jìn)感染的持續(xù)性發(fā)展。其具體機制待進(jìn)一步深入研究。機體免疫細(xì)胞種類繁多，作用機制復(fù)雜。因此，深入研究細(xì)粒棘球蚴感染的免疫機制，對進(jìn)一步設(shè)計有效控制感染的免疫治療方法至關(guān)重要。

利益沖突：無