邢詒喜，陳維飛，姚奇岑，林千祺，梁 金，黃美瓊，張瑞城

0 引言

腎臟間質(zhì)纖維化是慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)發(fā)展至終末期腎病的必經(jīng)之路，阻止腎臟間質(zhì)纖維化即是保護(hù)腎功能、防治慢性腎病的主要藥物治療靶點(diǎn)[1]。依那普利(Enalapril)是臨床上常用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)[2]，主要用于高血壓、心力衰竭的治療[3]，臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，ACEI藥物具有腎保護(hù)作用[4]。本研究應(yīng)用單側(cè)輸尿管梗阻(Unilateral urethral obstruction，UUO)大鼠模型探討依那普利對(duì)腎臟間質(zhì)纖維化的抑制作用，并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 依那普利片為江蘇揚(yáng)子江制藥公司產(chǎn)品(批號(hào)：18102455)，水合氯醛鈉為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品(批號(hào)：1810023313)，P65、TGF-β1、Smad3、Histone、β-actin抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(貨號(hào)：ab30186、ab22174、ab02871、ab30185、ab20117)，Masson 染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司(批號(hào)：20180914)，奧林巴斯顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品(BX53MRF-S)，雙垂直(DYCZ-25D)和轉(zhuǎn)印電泳儀(DYCZ-40G)為北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只清潔級(jí)SD雄性大鼠購(gòu)自海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，6～8周齡，體重180～210 g，清潔級(jí)環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，進(jìn)行UUO模型制作。

1.3 實(shí)驗(yàn)造模、給藥 參考本課題組的方法構(gòu)建UUO大鼠模型[5]，簡(jiǎn)述如下：使用數(shù)值表法將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、低劑量[10 mg/(kg·d)]依那普利組(低劑量組)和高劑量[20 mg/(kg·d)]依那普利組(高劑量組)，每組15只。60只SD大鼠給予10%水合氯醛鈉腹腔注射麻醉，假手術(shù)組暴露腎臟并分離出左側(cè)輸尿管后不結(jié)扎，關(guān)腹，縫合皮膚切口，模型組、依那普利組用4 號(hào)無(wú)菌絲線雙重結(jié)扎左側(cè)輸尿管，關(guān)腹，縫合皮膚切口。假手術(shù)組和模型組每天給等量生理鹽水灌胃，依那普利組給予相應(yīng)劑量依那普利灌胃，持續(xù)14 d。

1.4 腎組織的HE和Masson染色 14 d后，斷頸處死各組大鼠，取出患側(cè)腎臟組織送我院病理科制作石蠟切片，常規(guī)HE染色，200×光鏡下選取 10 個(gè)視野(左上、左下、右上、右下、中間各2個(gè))計(jì)算腎小管損傷評(píng)分，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、萎縮、壞死<10% 1分、<25% 2分、<50% 3分、<75% 4分、≥75% 5分。Masson 染色嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，Image 多媒體彩色病理圖像分析軟件采集圖像，計(jì)算Masson 染色陽(yáng)性面積占整個(gè)視野面積的百分比，計(jì)算腎間質(zhì)纖維化評(píng)分，百分比<10% 1分，<25% 2分、<50% 3分、<75% 4分、≥75% 5分。

1.5 Western blot檢測(cè) 14 d后，斷頸處死各組大鼠，取出50 mg患側(cè)腎臟組織，液氮下研磨，加入蛋白裂解液，混勻后，100 ℃水浴20 min，蛋白定量后每份樣品取10 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，1∶1 000稀釋入P65、TGF-β1、Smad3、Histone、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，加入二抗，使用堿性磷酸酯酶顯色后，曝光目的條帶。Bandscan 5.0軟件掃描各條帶，對(duì)照內(nèi)參histone和β-actin計(jì)算各目的條帶的相對(duì)灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟的組織病理學(xué)改變 從圖1可見，假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)正常，模型組、依那普利組腎小球萎縮，腎小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞空泡變性、壞死，可見蛋白管型，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。假手術(shù)組、模型組、低劑量組和高劑量組腎小管損傷評(píng)分分別為0.12±0.02、4.12±0.61、3.11±0.34、2.47±0.26，四組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.81，P<0.01)，其中依那普利組腎小管損傷評(píng)分顯著低于模型組(P<0.01)，高劑量組顯著低于低劑量組(P<0.01)。

2.2 腎臟間質(zhì)的Masson 染色結(jié)果分析 從圖2可見，模型組間質(zhì)纖維顯著增多，依那普利組間質(zhì)纖維顯著減少。假手術(shù)組、模型組、低劑量組和高劑量組腎間質(zhì)纖維化評(píng)分分別為0.26±0.05、3.64±0.53、2.48±0.36、1.83±0.22，四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.317，P<0.01)，其中，依那普利組腎間質(zhì)纖維化評(píng)分顯著低于模型組(P<0.01)，高劑量組低于低劑量組(P<0.01)。

圖1 四組腎組織HE染色(200×)

圖2 四組腎間質(zhì)Masson染色(200×)

2.3 依那普利對(duì)NF-κB/TGF-β1/Smad3通路的影響 從表1可見，四組P65、TGF-β1和Smad3蛋白相對(duì)灰度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中依那普利組P65、TGF-β1和Smad3蛋白相對(duì)灰度值顯著低于模型組(P<0.01)，高劑量組顯著低于低劑量組(P<0.01)。圖3顯示了相應(yīng)蛋白表達(dá)的變化。

表1 四組P65、TGF-β1和Smad3蛋白相對(duì)灰度值比較

圖3 蛋白的Western blot檢測(cè)

3 討論

腎纖維化是CKD疾病慢性進(jìn)展的主要病理變化，延緩腎間質(zhì)纖維化成為CKD疾病治療首要考慮的問題[6]。臨床使用中發(fā)現(xiàn)，ACEI抑制劑使用者腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)優(yōu)于未使用者[7]，但對(duì)其作用機(jī)制未做深入研究，楊慧等[8]研究發(fā)現(xiàn)，依那普利可以阻止腎間質(zhì)纖維化模型大鼠的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，腎小管上皮細(xì)胞既是慢性炎癥的受害者，同時(shí)受損的上皮細(xì)胞也可以分泌細(xì)胞因子參與到炎癥中，保護(hù)上皮細(xì)胞，阻止炎癥的級(jí)聯(lián)放大[9]。本研究通過構(gòu)建UUO大鼠模型，發(fā)現(xiàn)依那普利組腎小管損傷評(píng)分顯著低于模型組，也說(shuō)明依那普利對(duì)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，Masson染色分析依那普利組腎間質(zhì)纖維化評(píng)分顯著低于模型組，也說(shuō)明依那普利可以抑制腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。

CKD疾病腎間質(zhì)纖維化涉及到多種信號(hào)通路的激活[10]，其中TGF-β1在腎間質(zhì)纖維化中起到關(guān)鍵的作用[11]，TGF-β1借助Smads家族中的轉(zhuǎn)導(dǎo)分子轉(zhuǎn)移到核內(nèi)發(fā)揮基因調(diào)控作用[12]。Smad3是一個(gè)受體激活型小分子蛋白，可以促進(jìn)TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13-14]。本研究顯示，模型組TGF-β1和Smad3蛋白顯著高于假手術(shù)組，說(shuō)明了腎間質(zhì)纖維化TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活，而依那普利組TGF-β1和Smad3蛋白低于模型組，說(shuō)明依那普利可以抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路。NF-κB是炎癥和纖維化調(diào)控的上游通路，可以調(diào)節(jié)TGF-β1表達(dá)，P65是NF-κB通路中的關(guān)鍵蛋白，P65入核增多說(shuō)明NF-κB通路的激活。本研究顯示，模型組P65蛋白顯著高于假手術(shù)組，說(shuō)明NF-κB通路的激活，而依那普利組P65蛋白低于模型組，說(shuō)明依那普利可以抑制NF-κB通路信號(hào)通路，對(duì)TGF-β1/Smad3的抑制有可能是通過抑制NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)闡明。