孟 岑，盧雨昕，徐 剛，郝良純

0 引言

急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)是兒童最常見的惡性腫瘤，占兒童所有惡性腫瘤的30%。在過去20年中，隨著兒童ALL特異性化療的進(jìn)展，所有患者的生存率都有了顯著提高，約90%的兒童生存超過5年。甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)是一種抗葉酸化療藥物，能顯著降低白血病的復(fù)發(fā)率。然而，MTX治療往往會因為引起毒性而減少劑量或停止治療。目前，可通過檢測MTX血藥濃度，調(diào)整亞葉酸鈣的解救劑量和次數(shù)，直到MTX濃度在安全范圍內(nèi)。在實際治療中，相同MTX劑量的不同患者中，出現(xiàn)的藥物毒副反應(yīng)及MTX血藥濃度是因人而異的。研究表明，MTX代謝酶的相關(guān)基因可通過影響MTX的代謝過程，進(jìn)而影響其不良反應(yīng)及血漿濃度。因此，治療前檢測MTX代謝相關(guān)酶的基因型，準(zhǔn)確預(yù)測MTX治療的不良反應(yīng)程度，對ALL患者是非常有益的[1]。

1 MTX代謝過程及相關(guān)酶的作用

MTX是二氫葉酸還原酶(DHFR)的競爭性抑制劑。其結(jié)構(gòu)與生理性葉酸相似，可以通過還原葉酸載體(RFC1)介導(dǎo)[也稱為溶質(zhì)載體家族19成員1 (SLC19A1)轉(zhuǎn)運蛋白]，主動轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞后可直接以原形與二氫葉酸還原酶(DHFR)及其他靶酶結(jié)合，從而抑制DHFR的功能。在細(xì)胞內(nèi)，MTX 在多聚谷氨酰胺合成酶(Polyglutamyl synthetase，F(xiàn)PGs)的作用下被轉(zhuǎn)換成活性形式的多聚谷氨酸形式(MTX-PGs)，保留在肝臟及骨髓前身物質(zhì)及成纖維細(xì)胞中，這個過程能被γ-谷氨?；饷?GGH)逆轉(zhuǎn)，后者能催化γ-多聚谷氨酸的去除，從而推進(jìn)MTX流出細(xì)胞。MTX-PG與DHFR的結(jié)合力更強(qiáng)，且解離速度更慢，競爭性抑制DHFR的能力更強(qiáng)，從而抑制DNA和RNA的合成。此外，其能抑制將dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP的胸苷酸合成酶(TYMS)，從而提供另一種抑制DNA和RNA合成的途徑，故MTX可以通過原形及MTX-PG的形式抑制嘌呤的合成過程，造成細(xì)胞死亡，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用。MTX是通過不同的轉(zhuǎn)運體向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運的途徑從生物體中排出，使MTX代謝，從而降低MTX的有效水平。MTX通過轉(zhuǎn)運體家族(ATP-binding cassete，ABC)流出細(xì)胞，其中ABCC1-4及ABCG2在MTX流出細(xì)胞時發(fā)揮了主要作用。

2 MTX的不良反應(yīng)

MTX已廣泛應(yīng)用于大多數(shù)惡性血液病的化療方案中。MTX，尤其是高劑量MTX (HD-MTX)作為目前兒童ALL治療方案的主要組成部分，與臨床治療成功顯著相關(guān)。同時，HD-MTX可能引起毒性，導(dǎo)致應(yīng)用劑量減少或治療中斷，危及生存。

MTX的不良反應(yīng)體現(xiàn)在各個系統(tǒng)中，報道較多的MTX(包括大劑量MTX和MTX緩解維持治療)不良反應(yīng)是潰瘍性口炎、惡心、發(fā)熱和白細(xì)胞減少。MTX的其他不良反應(yīng)按各器官系統(tǒng)表現(xiàn)如下：消化系統(tǒng)，牙齦炎、咽炎、口腔炎、厭食癥、惡心、嘔吐、腹瀉、胃腸潰瘍和出血、腸炎、胰腺炎、肝功能異常等；骨髓抑制，血小板減少、貧血、白細(xì)胞減少、中性粒細(xì)胞減少等；泌尿系統(tǒng)，腎功能異常、蛋白尿等；心血管系統(tǒng)，心包炎、心包積液、低血壓、血栓栓塞事件等；中樞神經(jīng)系統(tǒng)，頭痛、嗜睡、視力模糊等。

由于化療藥物引起的毒副作用導(dǎo)致化療暫?；蚪K止，可使ALL復(fù)發(fā)或死亡增加。同時，臨床研究顯示，不同個體使用相同劑量MTX出現(xiàn)的臨床療效及毒副反應(yīng)各不相同，治療過程中藥物對人體的療效和毒副反應(yīng)的嚴(yán)重程度很難預(yù)測，會導(dǎo)致排泄延遲的患兒出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。有研究表明，MTX在藥代動力學(xué)、有效性和毒性方面存在個體差異，提示可能有一些潛在的基因靶點影響MTX的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)[2]。MTX在細(xì)胞內(nèi)代謝過程復(fù)雜，有一系列代謝關(guān)鍵酶及轉(zhuǎn)運蛋白，其基因多態(tài)性極可能是造成毒副作用差異的重要原因。

3 MTX代謝酶的藥物遺傳學(xué)

藥物遺傳學(xué)是研究藥物代謝途徑中遺傳基因差異的學(xué)科，主要研究藥物代謝酶、靶點、轉(zhuǎn)運體的遺傳變異及其相互作用如何產(chǎn)生特定的藥物相關(guān)表型。常見的遺傳變異有單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、拷貝數(shù)變異、基因組的小插入和缺失。MTX治療的臨床結(jié)果是由許多影響MTX藥代動力學(xué)和藥效學(xué)的基因產(chǎn)物的相互作用所決定。此外，遺傳信息通常用于個性化藥物選擇和劑量。多項研究均表明，編碼膜內(nèi)或膜外轉(zhuǎn)運蛋白的基因中的SNPs與MTX的藥代動力學(xué)、毒性和臨床療效的個體間差異有關(guān)。

目前，用于評估MTX治療的有效性及不良反應(yīng)的常見基因：MTHFR、TYMS、ATIC、AMPD-1、ITPA、MTR、MTRR等。

3.1MTHFR基因 亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是參與葉酸循環(huán)的重要酶。MTHFR催化5,10-甲基戊二氫葉酸(5,10-CH2-THF)不可逆地轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸(5-CH-THF)，前者是嘌呤和胸腺嘧啶的合成所需，后者為同型半胱氨酸在MTX的作用下甲基化生成蛋氨酸的甲基供體，這是蛋白質(zhì)合成和核酸甲基化所必需的[3-5]。由于MTHFR活性的改變，葉酸的減少可能使惡性和非惡性細(xì)胞對MTX的反應(yīng)產(chǎn)生顯著影響。因此，5,10-CH2-THF轉(zhuǎn)化為5-CH2-THF，隨后在胞內(nèi)葉酸池中進(jìn)行修飾，可能會增加MTX的毒性效應(yīng)。Den等[6]研究了35例新診斷為ALL的患者，結(jié)果MTHFR677C>T多態(tài)性與血漿MTX水平無顯著相關(guān)性。近年來，研究主要集中在2種單核磷酸多態(tài)性上：677C>T (rs1801133)和1298A>C (rs1801131)。Yao等[7]納入了17項研究(2007-2016年發(fā)表的隊列研究，共納入2 133例患者)進(jìn)行了Meta分析，研究沒有觀察到MTHFRC677T基因多態(tài)性與MTX治療后不良反應(yīng)的發(fā)生有任何相關(guān)性。Wang等[8]的研究中指出，與MTHFR-677CC和MTHFR-677CT相比，MTHFR-677TT基因攜帶者M(jìn)TX相關(guān)的不良反應(yīng)報告更多。Yang等[9]闡述了MTHFR677T突變與肝臟毒性顯著相關(guān)，而A1298C僅與皮膚毒性(黏膜炎)相關(guān)。Lopez-Lopez等[10]研究結(jié)果顯示，C677T和A1298C突變與兒童使用HD-MTX的毒副作用相關(guān)性較低。Umerez等[11]總結(jié)了13篇選定的文獻(xiàn)，分析了677C>T多態(tài)性與MTX毒性之間的關(guān)系。其中，只有5項研究發(fā)現(xiàn)其與毒性顯著相關(guān)，但結(jié)果相反，3項研究認(rèn)為，T變異等位基因與毒性風(fēng)險的增加相關(guān)[12-14]，而另外2項研究認(rèn)為，其與風(fēng)險的降低相關(guān)[15-16]。在選擇的13篇文獻(xiàn)中，10篇討論了1298A>C多態(tài)性與MTX誘導(dǎo)毒性的關(guān)系。其中，只有3項研究發(fā)現(xiàn)兩者之間存在相關(guān)性，但效果存在矛盾?？紤]到相反的結(jié)果，幾乎沒有研究發(fā)現(xiàn)這種多態(tài)性與MTX誘導(dǎo)的毒性之間有顯著的關(guān)聯(lián)。而Zhu等[17]的Meta分析研究表明，MTHFR677T多態(tài)性與MTX毒性(特別是黏膜炎)有關(guān)，未發(fā)現(xiàn)MTHFRA1298C多態(tài)性在預(yù)測MTX毒性風(fēng)險中起作用。Choi等[18]研究表明，MTHFR677C>T多態(tài)性是預(yù)測MTX相關(guān)血液毒性的獨立標(biāo)志物。結(jié)果顯示，除了血清MTX水平以外的其他因素在MTX毒性方面亦發(fā)揮作用，且MTX的肝毒性和口腔黏膜炎與血清中MTX水平無關(guān)。Xu等[19]研究了109例應(yīng)用大劑量MTX治療的患者，結(jié)果提示，在rs1801133基因型TT中，重度肝毒性或黏膜炎的發(fā)生率更高，等位基因T使嚴(yán)重肝毒性和黏膜炎的風(fēng)險分別增加了1.98倍和2.06倍，但沒有發(fā)現(xiàn)其與血液毒性及腎毒性存在相關(guān)性。

3.2TYMS基因 胸苷酸合成酶(TYMS)催化脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP)甲基化生成脫氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)，抑制TYMS可導(dǎo)致脫氧胸苷三磷酸(dTTP)耗竭，從而導(dǎo)致染色體斷裂和細(xì)胞死亡。因此，TYMS是治療急性淋巴細(xì)胞白血病的關(guān)鍵酶，是MTX最重要的靶點之一。在TYMS基因中存在多種多態(tài)性，包括rs34743033、rs2853542和rs34489327。多態(tài)性rs34743033是在TYMS5′-非翻譯區(qū)(5′-UTR)中有28個堿基的可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)。通過觀察具有3個串聯(lián)重復(fù)序列(3R)、2個串聯(lián)重復(fù)序列(2R)或雜合基因型(3R/2R)的個體，發(fā)現(xiàn)VNTR3R等位基因比2R等位基因有更多的TYMS表達(dá)[20]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs2853542G>C位于VNTR3R等位基因的第2次重復(fù)中。rs2853542C等位基因?qū)е略鰪?qiáng)子破壞，降低了TYMS表達(dá)。多態(tài)性rs34489327是TYMS3′-非翻譯區(qū)(3′-utr)中的1個6-bp (TTAAAG)缺失，rs344893276-bp等位基因可能改變mRNA的穩(wěn)定性，降低TYMS水平。Wang等[21]對118例中國兒童進(jìn)行研究，結(jié)果表明，TYMSrs2790A>G多態(tài)性的分布具有明顯的民族差異，但不能證明基因型的不同可以導(dǎo)致血液毒性。Oosterom等[22]對112例ALL患兒進(jìn)行研究，結(jié)果提示，TYMS 6-bp缺失和2R、3R多態(tài)性與MTX誘導(dǎo)的口腔黏膜炎無關(guān)。

3.4GGH基因 谷氨酸水解酶(GGH)是一種溶酶體酶，能夠使MTX多聚谷氨酸鹽(MTX-PGs)水解，并使其再次轉(zhuǎn)變成游離的MTX，流出細(xì)胞外。GGH的多態(tài)性可以通過影響MTX活性，進(jìn)而影響MTX的作用。GGH基因的啟動子區(qū)中，-401C>T突變可以使GGH酶活性增強(qiáng)，從而加快細(xì)胞內(nèi)MTX-PGs的水解速度，使更多的MTX可以流出細(xì)胞外。因此，CC型患者與突變型患者相比，會因為細(xì)胞內(nèi)MTX-PGs的水平更高，使不良反應(yīng)發(fā)生率更高。Dervieux等[27]認(rèn)為，CC型患者發(fā)生不良反應(yīng)的幾率高于CT型和TT型患者；Ghodke-Puranik等[28]的研究顯示，TT型患者的不良反應(yīng)發(fā)生率更高；而Yamamoto等[29]的研究則提示，基因多態(tài)性與不良反應(yīng)之間并無相關(guān)性。Koomdee等[26]研究納入105例ALL患兒，提示GGH-401CT和TT基因型與兒童嚴(yán)重白細(xì)胞減少癥和血小板減少癥有關(guān)[30]。Yang等[31]的研究提示。GGH基因(rs719235、rs10464903、rs12681874)多態(tài)性與HD-MTX相關(guān)毒性的發(fā)生率無關(guān)。

4 MTX運載體藥物遺傳學(xué)

MTX的流入/流出機(jī)制取決于兩個主要的超家族：溶質(zhì)載體(SLC)轉(zhuǎn)運體和ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運體。MTX主要通過還原葉酸載體1 (RFC1)介導(dǎo)的主動轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞，MTX的外排主要由ABC轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)。RFC1的作用是雙向的，但其流動能力低于ABC轉(zhuǎn)運體。此外,當(dāng)MTX濃度達(dá)到20 μmol/L，被動擴(kuò)散可能也發(fā)揮了一定作用。研究MTX藥代動力學(xué)和藥效學(xué)中轉(zhuǎn)運體的作用，有助于在所有MTX治療中獲得合理的應(yīng)用。

4.1RFC-1基因RFC-1也稱為溶質(zhì)載體家族19成員1 (SLC19A1)，是MTX的轉(zhuǎn)運載體，可影響MTX的抗腫瘤活性。人類RFC基因位于21號染色體q22.2～q22.3，編碼包含591個氨基酸的完整膜蛋白。其中，G80A是一種常見的SNP，發(fā)生在RFC-1基因的第2個外顯子中，可導(dǎo)致精氨酸取代組氨酸。這種替代可能干擾葉酸和MTX進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)運，并可能改變轉(zhuǎn)運體的親和力。He等[32]對兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者進(jìn)行Meta分析，從7個方面進(jìn)行研究，在血小板減少、白細(xì)胞減少、骨髓抑制、黏膜炎、肝毒性、神經(jīng)毒性、血漿MTX水平方面未發(fā)現(xiàn)與G80A多態(tài)性存在關(guān)聯(lián)，最后認(rèn)為，在兒童ALL中，RFC1G80A多態(tài)性不是MTX相關(guān)毒性的良好標(biāo)志物。而在Gregers等[33]對丹麥的500例白血病患兒的研究中，發(fā)現(xiàn)RFC80AA患者骨髓毒性更高，試驗中其血小板最低點明顯低于GA/GG組；而GG組的肝臟毒性更大。Kotnik等[34]的實驗表明，在另一種基因多態(tài)性rs2838958中，rs2838958TT基因型患者比攜帶至少1個C等位基因的患者發(fā)生黏膜炎的可能性更高。

4.2 ABC轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因 MTX通過細(xì)胞外排轉(zhuǎn)運體從細(xì)胞中清除，不僅通過有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運體，還通過ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運體，其中ABC轉(zhuǎn)運蛋白可分為8 個亞家族(ABCA-ABCG)。

4.2.1ABCB1基因ABCB1基因編碼P-糖蛋白1，縮寫為P-gp1或Pgp1，具有跨膜滲透泵的作用，表達(dá)在腸上皮細(xì)胞頂膜、肝細(xì)胞、腎近端小管和血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞。Gregers等[35]提出，在丹麥人群中，ABCB11199G>A變異與MTX在兒童所有治療中的療效和毒性顯著相關(guān)。Ramírez-Pacheco等[36]對墨西哥患兒進(jìn)行的一項研究表明，ABCB1rs1045642處的CC純合子出現(xiàn)血漿中高M(jìn)TX水平和白細(xì)胞減少的風(fēng)險較低。此外，在黎巴嫩的一項研究中，中性粒細(xì)胞減少癥與ABCB1rs1045642和rs1128503的變異等位基因攜帶者之間存在顯著的統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)[37]。Liu等[38]對322例中國患兒進(jìn)行研究，結(jié)果表明，與TT基因型患者相比，ABCB1rs1128503C等位基因的患者在接受HD-MTX治療后發(fā)生口腔黏膜炎的風(fēng)險更高。Dervieux等[28]發(fā)現(xiàn)，rs1128503與中性粒細(xì)胞減少癥相關(guān)。

4.2.2ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5ABC轉(zhuǎn)運蛋白的多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)家族表達(dá)于許多屏障組織的細(xì)胞膜中，其中MRP2 (ABCC2)、MRP3 (ABCC3)、MRP4 (ABCC4)和MRP5 (ABCC5)在MTX的結(jié)合和轉(zhuǎn)運中得到了廣泛的研究。MRP1-4只轉(zhuǎn)運單谷氨酸MTX形式，MRP5能夠轉(zhuǎn)運與MTX單谷氨酸類似的二谷氨酸。因此，MRP5可能導(dǎo)致耐藥性。一項對65例B-ALL患兒進(jìn)行的橫斷面研究，評估ABCC2基因多態(tài)性之間的關(guān)系，研究-24CT(rs717620)、1249GA(rs2273697)、3972CT(rs3740066)與MTX的血清水平和毒性的關(guān)系。結(jié)果表明，3972T等位基因攜帶者與肝毒性呈顯著負(fù)相關(guān)，而1249A等位基因攜帶者的消化道毒性呈上升趨勢。同時，這3種多態(tài)性與MTX血清水平無顯著關(guān)系[39]。Ansari等[40]對273例ALL患兒的研究證實，ABCC3rs9895420A-189等位基因與MTX外排相關(guān)，從而降低了所有患兒的藥物敏感性。結(jié)果表明，AA和AT基因型與無事件生存(EFS)的降低、血漿MTX水平的升高、中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)發(fā)風(fēng)險的升高以及2級血小板減少癥的發(fā)生率較低有關(guān)。Ansari等[40]還分析了ABCC4基因中的8個SNPs。結(jié)果顯示，T1393C多態(tài)性的TC基因型與更好的EFS和更低的血漿MTX水平相關(guān)。相反，A934C的CA基因型(rs2274407)與EFS減少及高級別血小板減少癥發(fā)生率升高相關(guān)。此外，934CC基因型與血液毒性和提高乳酸脫氫酶(LDH)水平[5]相關(guān)。根據(jù)Den Hoed等[6]對134例ALL患兒的研究，野生型ABCC4rs7317112AA基因型的黏膜炎發(fā)生率高于AG/GG基因型。

MTX不良反應(yīng)的個體差異較大，目前研究表明，ABCB1、MTHFR等基因多態(tài)性與MTX不良反應(yīng)密切相關(guān)，但結(jié)果不盡相同。研究結(jié)果不同的原因可能是：①宿主因素可能是陰性結(jié)果的主要原因之一。宿主自身的疾病狀況、化療的具體用藥方案、服藥依從性可能降低研究結(jié)果的適用性和可靠性。②不同研究中不良反應(yīng)的評價標(biāo)準(zhǔn)可能會導(dǎo)致結(jié)果的差異。③部分研究樣本量過小，部分研究樣本量過大，使得本研究可能存在嚴(yán)重的臨床異質(zhì)性。④由于隨訪時間和隨訪計劃存在差異，結(jié)果可能存在差異。⑤在MTX進(jìn)入機(jī)體的整個過程中，還有許多重要的因素酶和影響其代謝和排泄途徑的轉(zhuǎn)運體。這些基因的多態(tài)性是否為干擾因素及影響不同基因在體內(nèi)的作用尚不能排除。

總之，患者的基因型應(yīng)結(jié)合其他臨床特征進(jìn)行評估，如病理生理學(xué)、飲食、藥物-藥物相互作用、藥物過敏和依從性，尤其是在調(diào)整藥物劑量以達(dá)到最大效果和整個治療過程的安全性方面。目前，只有少數(shù)特定的藥物在臨床中應(yīng)用基因遺傳學(xué)進(jìn)行劑量調(diào)整，通?；谝阎绊懰幬锼幋鷦恿W(xué)的基因變異，已證實可以導(dǎo)致血漿藥物水平和/或代謝物水平的改變。然而，藥物遺傳學(xué)研究通常是在患者有藥物問題時進(jìn)行的。因此，該領(lǐng)域的一些學(xué)者主張“先發(fā)制人的研究是解決之道”。在對MTX相關(guān)酶進(jìn)行基因檢測的基礎(chǔ)上，“先發(fā)制人”地選擇MTX劑量，需要更多的前瞻性隨機(jī)試驗來調(diào)查臨床結(jié)果。尋找有效預(yù)測MTX不良反應(yīng)的基因型，使臨床個體化實施大劑量MTX化療方案，減少藥物相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生，讓患兒最大程度受益。