周發(fā)忱,舒鑫,周欣
(大連醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院胸外科,遼寧 大連 116011;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室,遼寧 大連 116044)
肺癌具有高發(fā)病率和高死亡率,嚴(yán)重影響人類的生命健康。中國的肺癌發(fā)病率高于全球,新發(fā)病例約占全球肺癌新發(fā)病例的37%[1]。近年來肺癌的診斷和治療方法均有突破,但肺癌患者預(yù)后差仍是目前面臨的嚴(yán)峻問題,統(tǒng)計(jì)表明,只有約7%的肺癌患者生存期超過5年[2-3]。肺癌細(xì)胞的惡性增殖和遷移是肺癌患者死亡的主要原因。因此,對肺癌發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行探討,對改善肺癌患者預(yù)后、延長生存期具有重要意義。
長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類存在于真核生物基因組中轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的RNA分子,定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì),但大多數(shù)不翻譯成蛋白質(zhì)[4]。有研究[5-6]表明,lncRNA在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中均異常表達(dá),其調(diào)控的基因表達(dá)可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平,在細(xì)胞凋亡、周期、增殖、遷移和化學(xué)抗性中擔(dān)任重要角色。近年來lncRNA對腫瘤進(jìn)展的調(diào)控作用受到廣泛關(guān)注,其既能作為原癌基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展,也能在腫瘤進(jìn)展過程中起到抑制作用,發(fā)揮抑癌基因的功能[7-8]。然而,肺癌中l(wèi)ncRNA的詳細(xì)分子機(jī)制尚不明確,需要進(jìn)行深入研究。
lnc-ZNF37A-2是2014年發(fā)現(xiàn)的一種新的lncRNA[9],在易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞(HCCLYM-H2)中高表達(dá),與定位相鄰的可預(yù)測肺癌復(fù)發(fā)的H2AFY2基因共表達(dá)。但其在肺癌中的作用和機(jī)制目前仍不清楚。本研究通過生物信息學(xué)分析,采用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫,分析lnc-ZNF37A-2(AL133271.1)在不同分期肺癌組織中的表達(dá)差異和臨床意義,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探討lnc-ZNF37A-2對肺癌細(xì)胞A549遷移和侵襲能力的影響。
1.1.1 細(xì)胞系:肺癌細(xì)胞株A549、H1299購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。
1.1.2 主要試劑:RPMI 1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清購自美國Hyclone公司;TRIzol試劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PCR Master Mix購自日本TaKaRa公司;siRNA-lnc-ZNF37A-2、陰性對照siRNA和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;Transwell小室購自美國CORNING公司。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱,使用含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁且占滿培養(yǎng)皿底面積的80%~90%后傳代。
1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR):將細(xì)胞用PBS清洗3遍,TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系根據(jù)說明書配置,合成cDNA后,將cDNA稀釋10倍,進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR,以2-ΔΔCt法定量分析,使用人GAPDH為內(nèi)參,RNA free H2O為陰性對照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。GAPDH引物:上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’;lnc-ZNF37A-2引物:上游5’-TTGCCCTGGTGTGCTGCTTTG-3’,下游5’-AGTCCATCCTCATCCTCTCCCATG-3’。
1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將細(xì)胞接種到6孔板中,培養(yǎng)24 h后密度達(dá)到70%,轉(zhuǎn)染。設(shè)立lnc-ZNF37A-2干擾組(si-lnc-ZNF37A-2組)、陰性轉(zhuǎn)染組(NC組)、空白對照組。將 Lipofectamine 2000與si-lnc-ZNF37A-2或si-NC混合(終濃度為100 nmol/L)構(gòu)建轉(zhuǎn)染體系,將混合液加入6孔板中,37 ℃培養(yǎng)4 h,更換RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。lnc-ZNF37A siRNA:順義,5’-AGUGAUAAGUGAAAUGGUGCA-3’,反義,5’-CACCAUUUCACUUAUCACUUU-3’。
1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力:采用傷口愈合測定法評估細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞以6×105/孔的密度鋪6孔板。當(dāng)細(xì)胞生長到100%匯合時(shí),使用200 μL移液管吸頭劃傷傷口。用PBS將培養(yǎng)板洗滌3次,以除去細(xì)胞碎片,然后將細(xì)胞培養(yǎng)于不含胎牛血清的不完全RPMI 1640培養(yǎng)基中,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡下拍攝初始傷口和培養(yǎng)48 h后恢復(fù)區(qū)域。計(jì)算傷口愈合面積,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力:每個(gè)Transwell小室(孔徑為8 μm)的上室加入1 ∶4體積比的基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基混合液100 μL,待基質(zhì)膠凝固后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),評估細(xì)胞的侵襲能力。待細(xì)胞長到適宜密度后無血清處理4 h;收集饑餓處理過的細(xì)胞,上室接種細(xì)胞5×104/孔,加入無血清培養(yǎng)基200 μL,下室加入700 μL完全培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h;取出小室,PBS清洗3次,4%多聚甲醛室溫固定30 min;PBS清洗3次,晾干后加入600 μL 0.2%的結(jié)晶紫溶液,室溫染色30 min,用棉簽小心擦掉上室細(xì)胞,在正置光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野以計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.6 生物信息學(xué)分析:訪問GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)主頁,進(jìn)入單基因分析中的Stage Plots頁面,能夠可視化分析不同分期的lnc-ZNF37A-2表達(dá)量。訪問starBase v3.0(http://starBase.sysu.edu.cn)主頁,進(jìn)入Pan-Cancer頁面,分析lnc-ZNF37A-2表達(dá)量與肺癌患者總生存期的關(guān)系。利用在線數(shù)據(jù)庫Co-LncRNA(http://www.bio-bigdata.com/Co-LncRNA/)中肺癌數(shù)據(jù)集(GSE34329),查找與lnc-ZNF37A-2共表達(dá)的mRNA,并繪制共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),之后將預(yù)測得到的共表達(dá)基因在CEGsFuncs菜單中進(jìn)行GO和KEGG基因功能富集分析。利用starBase v3.0網(wǎng)站預(yù)測lnc-ZNF37A-2與ANAI1、FOXC2和TWIST1表達(dá)的相關(guān)性。
采用GraphPad Prism 7.0軟件處理數(shù)據(jù),不同病理分期表達(dá)差異的比較采用F檢驗(yàn);生存曲線比較采用log-rank(Mantel-Cox)檢驗(yàn);2組間比較采用配對樣本t檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析485例不同肺癌分期患者的組織樣本中l(wèi)nc-ZNF37A-2表達(dá)的差異(圖1),結(jié)果發(fā)現(xiàn),lnc-ZNF37A-2在Ⅰ期患者中表達(dá)較低,在Ⅳ期患者中表達(dá)最高,提示lnc-ZNF37A-2在晚期肺癌組織中高表達(dá),可能發(fā)揮癌基因的作用。
圖1 lnc-ZNF37A-2在不同病理分期的肺癌患者中的表達(dá)Fig.1 The expression of lnc-ZNF37A-2 for different pathological stages in lung cancer patients
應(yīng)用log-rank檢驗(yàn)分析lnc-ZNF37A-2表達(dá)水平與肺癌患者總生存期的關(guān)系(圖2),結(jié)果發(fā)現(xiàn),lnc-ZNF37A-2表達(dá)對肺癌患者總生存期可能有影響,lnc-ZNF37A-2高表達(dá)的部分肺癌患者總生存期縮短(P=0.3)。
圖2 lnc-ZNF37A-2表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性Fig.2 Relationship between the expression of lnc-ZNF37A-2 and the prognosis of lung cancer patients
為了探究lnc-ZNF37A-2影響患者預(yù)后的原因,通過Co-LncRNA網(wǎng)站預(yù)測與lnc-ZNF37A-2相關(guān)的mRNA,共發(fā)現(xiàn)107個(gè)基因與lnc-ZNF37A-2共表達(dá)(圖3A)。對共表達(dá)的基因的生物過程(GO:BP)、細(xì)胞組分(GO:CC)、分子功能(GO:MF)進(jìn)行功能富集分析(圖3B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),共表達(dá)基因與幾個(gè)過程有關(guān),如碳酸氫鹽運(yùn)輸、細(xì)胞基質(zhì)黏附、小分子代謝過程、胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)控。細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、轉(zhuǎn)化生長因子β信號(hào)通路和氧化磷酸化調(diào)節(jié)的信號(hào)通路是富集的主要通路。提示lnc-ZNF37A-2在肺癌細(xì)胞侵襲、遷移活性的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
驗(yàn)證siRNA對細(xì)胞中l(wèi)nc-ZNF37A-2表達(dá)的干擾效率,通過實(shí)時(shí)PCR檢測A549、H1229細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-lnc-ZNF37A-2后lnc-ZNF37A-2的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對照組和NC組比較,轉(zhuǎn)染siRNA-lnc-ZNF37A-2的A549和H1229細(xì)胞中l(wèi)nc-ZNF37A-2表達(dá)明顯降低(圖4A),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.001),說明該siRNA可沉默肺癌細(xì)胞中l(wèi)nc-ZNF37A-2的表達(dá)。
由于A549細(xì)胞中siRNA-lnc-ZNF37A-2沉默效率高,因此使用A549細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移水平的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn),A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-lnc-ZNF37A-2使其沉默后,細(xì)胞遷移能力明顯降低(圖4B),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.001)。通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測抑制肺癌細(xì)胞中l(wèi)nc-ZNF37A-2表達(dá)后細(xì)胞侵襲能力的改變,結(jié)果表明,A549細(xì)胞中沉默lnc-ZNF37A-2后,與NC組比較,siRNA-lnc-ZNF37A-2組細(xì)胞的侵襲能力明顯降低(圖4C)(P< 0.001)。提示lnc-ZNF37A-2在肺癌細(xì)胞侵襲、遷移的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
圖3 lnc-ZNF37A-2共表達(dá)的mRNA網(wǎng)絡(luò)與基因富集分析Fig.3 The network of co-expressed mRNAs with lnc-ZNF37A-2 and gene enrichment analysis
肺癌是發(fā)病率和死亡率很高的惡性腫瘤,主要原因?yàn)樵缙谠\斷難度較大,確診時(shí)多為中晚期并已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,患者錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)機(jī),而且治療后易局部復(fù)發(fā)。但肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制尚未完全明確,臨床研究推測與趨化因子刺激、基質(zhì)成分降解和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等有關(guān)[10-12]。因此,早期準(zhǔn)確評價(jià)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的情況對有效治療和改善預(yù)后至關(guān)重要。
lncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”,隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,大量具有生物學(xué)功能的lncRNA進(jìn)入人們的視野。近來研究表明,lncRNA通過表觀遺傳學(xué)修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平以及可變剪接調(diào)控細(xì)胞周期、分化、凋亡等發(fā)揮生物學(xué)作用,如HOTAIR、AK126698、HOTTIP和TUG1等lncRNA明顯影響肺癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、化療藥物敏感性等不同生物學(xué)功能[6,13-14]。以往研究[9,15]發(fā)現(xiàn),在易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞H2中,lnc-ZNF37A-2(RP11-672F9.1)的表達(dá)量顯著增加,與lnc-ZNF37A-2共表達(dá)的鄰近基因H2AFY2與肺癌復(fù)發(fā)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),與Ⅰ~Ⅲ期肺癌患者相比,lnc-ZNF37A-2在Ⅳ期肺癌患者中表達(dá)量上調(diào),提示lnc-ZNF37A-2與肺癌的進(jìn)展相關(guān);且lnc-ZNF37A-2高表達(dá)的患者總生存期較短,提示其有望成為預(yù)測肺癌預(yù)后的指標(biāo)。然后,通過富集分析與lnc-ZNF37A-2共表達(dá)的mRNA,推測lnc-ZNF37A-2與細(xì)胞黏附以及細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用相關(guān),可能影響肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討lnc-ZNF37A-2對肺癌細(xì)胞A549侵襲、遷移的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑制肺癌細(xì)胞中l(wèi)nc-ZNF37A-2表達(dá),肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著降低,表明lnc-ZNF37A-2可能通過促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移參與肺癌的發(fā)展。
本研究仍有以下不足,首先是缺少機(jī)制證據(jù)說明這些結(jié)果直接相關(guān);其次,lnc-ZNF37A-2對肺癌細(xì)胞增殖和藥物敏感性有何影響及可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
綜上所述,本研究利用大數(shù)據(jù)挖掘結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lnc-ZNF37A-2在晚期肺癌組織中高表達(dá),且與患者不良預(yù)后相關(guān);沉默lnc-ZNF37A-2表達(dá)會(huì)減弱肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力,此過程可能是通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞黏附和細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用實(shí)現(xiàn)的。
圖4 沉默lnc-ZNF37A-2的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力Fig.4 Invasion and migration capability was inhibited after silencing lnc-ZNF37A-2 expression in lung cancer cells
中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2020年7期