王長海，張曉艷，李金花

(林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

楊樹是世界范圍內(nèi)重要的工業(yè)用材林樹種[1]，楊樹人工林在我國北方生態(tài)防護林和工業(yè)用材林建設(shè)中發(fā)揮了巨大作用，高產(chǎn)、多抗和優(yōu)質(zhì)是我國楊樹新品種選育的目標(biāo)性狀[2]。雜交育種是楊樹育種的重要途徑，有效的早期選擇是縮短育種周期、提高育種效率的重要手段[3]。葉片作為植物體的重要器官，是植物進行光合作用和蒸騰作用的主要場所，對光能、水分的利用以及干物質(zhì)的積累等方面具有直接的影響[4-6]。葉片大小、形態(tài)和結(jié)構(gòu)等方面的特征與楊樹的生長密切相關(guān)，在楊樹育種方面具有重要的作用，有研究發(fā)現(xiàn)，這些性狀受到較強的遺傳控制[7-10]。因此，葉形變異研究對楊樹遺傳改良和早期選擇具有重要意義。

隨著計算機技術(shù)的興起，利用圖像法結(jié)合軟件對葉片進行測量與分析的研究逐漸發(fā)展起來[11-13]。高建昌等利用Leaf J 軟件構(gòu)建了一種番茄（Solanum lycopersicum）葉面積的測定方法[14]，李樂等利用Digimizer 軟件對蒙古櫟（Quercus mongolica Fisch.ex Ledeb）葉面積進行測定，并建立了起葉面積估測模型[15]。與傳統(tǒng)的測量方法相比，這些軟件具有測量速度快、精確度高的特點。但是，目前軟件法應(yīng)用于葉片研究，大多是利用軟件進行葉面積、葉長、葉寬等數(shù)量形態(tài)性狀的測定和分析。同時，由于葉形變異難以量化，僅通過葉片形態(tài)數(shù)量性狀無法直觀全面地描述葉形變異[16-17]。為彌補葉片數(shù)量性狀分析不夠全面直觀的缺點，研發(fā)出了一系列軟件用于開展葉形變異分析，例如基于生物形態(tài)變異定量分析的SHAPE（2002）[18]，自動識別葉片邊界并進行性狀測量的LAMINA（2008）[19]和LeafAnalyser（2008）[16]，基于疊印法葉形變異分析的MorphoJ（2011）[20]，基于Image J 軟件葉形變異分析腳本Leaf J（2013）[21]，以及基于MATLAB 平臺的可視化葉片圖像處理分析軟件LeafletAnalyzer（2015）[22]等。LeafAnalyser 軟件是Weight 等（2008）開發(fā)的用于分析葉形變異主成分的大通量葉形分析軟件，具有操作簡單、便捷，識別快速，結(jié)果直觀等特點[16]，通過自動識別葉片的輪廓，利用標(biāo)記點標(biāo)記葉片形狀并轉(zhuǎn)化為葉形輪廓模型，再通過葉形輪廓模型的對比，分析影響葉形態(tài)變異的主成分。MorphoJ 軟件是Klingenberg（2011）開發(fā)出的葉形變異分析軟件，通過疊印法去除了來自葉片大小與圖像比例的影響，能直觀地分析葉片形態(tài)特征上的變異類型和變異程度[20]。這些軟件作為葉片形態(tài)數(shù)量性狀在葉形變異分析中的有效補充，有效解決了單純基于數(shù)量性狀的葉形變異分析不夠全面的問題。

本研究利用通過掃描法獲得的小葉楊無性系‘1-XY’與歐洲黑楊無性系‘N139’及其雜交子代無性系的葉片圖像，使用Digimizer 軟件對葉面積、葉片周長、葉長、葉寬4 個葉片形態(tài)性狀進行了測定，使用leafAnanlyser 軟件建立葉片形態(tài)輪廓模型，使用LeafAnalyser 軟件和MorphoJ 軟件對葉形變異進行分析，確定影響葉形變異的主要因素，以評價葉形變異分析軟件在楊樹葉片形態(tài)性狀分析中的應(yīng)用性和可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以小葉楊優(yōu)良無性系‘1-XY’（母本）與歐洲黑楊優(yōu)良無性系‘N139’（父本）雜交F1代經(jīng)扦插擴繁后，與親本扦插苗一起定植于中國林科院豐南基地。田間試驗為5 株小區(qū)，株行距為30 cm×50 cm。當(dāng)年生長季選取生長一致、無病蟲害苗木1 株為標(biāo)準(zhǔn)株，采集自頂端向下第6～9 片葉片中的1 片，去柄后置于自封袋中編號并記錄。親本各隨機取樣1 株，雜交子代共計305 株，編號為1～305。

1.2 試驗地自然概況

中國林科院豐南基地位于河北省唐山市豐南區(qū)小集鎮(zhèn)（39°29′ N，118°16′ E），地處冀東濱海平原。暖溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候，四季分明，降水集中，風(fēng)向有明顯的季節(jié)變化。年平均氣溫12.5℃左右，最冷1 月平均氣溫-5.0℃，最熱7 月平均氣溫24.8℃，無霜期190 d 左右。年平均降水量596.4 mm。土壤為沙壤土。

1.3 葉片圖像獲取

使用惠普公司ScanJetG4010 型掃描儀對葉片進行掃描，分辨率為300 DPI，輸出格式為圖片文件（*.jpg）并保存。

1.4 葉片性狀測定與統(tǒng)計分析

使 用 Digimizer 軟 件（MedCalc Software bvba 公司）對葉片圖像進行葉面積、葉片周長、葉長、葉寬的測定。使用Excel 2007 軟件進行數(shù)據(jù)錄入和校對，利用IBM SPSS 19.0 軟件，計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.5 葉片形態(tài)變異分析

使用LeafAnanlyser 軟件建立葉片標(biāo)志點的葉形輪廓模型，以葉脈基部為葉形輪廓標(biāo)志點的起點，標(biāo)志數(shù)量為200 個，對葉片表型形態(tài)進行計量分析，生成并輸出包括葉形輪廓標(biāo)志點坐標(biāo)數(shù)據(jù)的文本文件（*.txt），進行葉片形態(tài)變異的主成分分析。使用MorphoJ 軟件通過普氏疊印法（Generalized Procrustes Analysis，GPA）對葉片標(biāo)志點數(shù)據(jù)進行主成分分析，形成葉片形態(tài)的可視化葉形輪廓圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交子代葉片統(tǒng)計參數(shù)

本研究雜交子代的母本小葉楊和父母歐洲黑楊分別屬于黑楊派和青楊派的兩個樹種，其葉形形狀存在較大的種間差異，小葉楊葉片較小，歐洲黑楊葉片較大。雜交子代葉片形態(tài)性狀的統(tǒng)計參數(shù)見表1。4 個性狀變異系數(shù)均大于10%，性狀變化幅度較大，其中葉片面積變異系數(shù)最大（31.74%），最大值為最小值的8 倍。雜交子代葉片葉面積頻率分布（圖1）符合正態(tài)分布，分布相對偏向于父本，葉面積平均值（73.39 cm2）與父本歐洲黑楊（72.95 cm2）相近。

2.2 基于LeafAnalyser 葉形變異的主成分分析

使用LeafAnalyser 軟件通過點位標(biāo)記對葉片形態(tài)性狀實現(xiàn)精確量化，利用200 個標(biāo)志點構(gòu)建了葉片的形態(tài)輪廓模型，根據(jù)標(biāo)志點的信息對葉形變異進行主成分分析（PCA），前四個主成分分析（PC1、PC2、PC3、PC4）結(jié)果（圖2）顯示，葉片上方為葉基，下方為葉尖，中間葉片表示平均葉的葉形輪廓，兩邊葉片為平均葉在該主成分影響下偏移兩倍標(biāo)準(zhǔn)差(2SD)的葉形輪廓。分析結(jié)果顯示，PC1 占總變量的87.52%，PC2、PC3 和PC4分別占總變量的4.27%、2%和1.6%。前兩者占總變量的91.79%，能夠解釋子代葉片形狀的主要差異。根據(jù)葉片形狀偏離平均葉的葉形輪廓的程度，對子代群體進行葉形變異分析，PC1 的葉形輪廓顯示，葉面積是對葉形變異第一主成分影響最大的因子。同理，葉尖、葉基和葉片主脈對稱性是PC2、PC3 和PC4 的主要影響因素，PC2 和PC3 的葉形輪廓呈現(xiàn)出菱形、闊圓形等特征，分別與母本小葉楊和父本歐洲黑楊的相似。

表1 雜交子代無性系葉片形態(tài)性狀統(tǒng)計參數(shù)Table 1 Statistical describing on leaf quantitative characters of hybrids

圖 1 雜交子代葉面積頻率分布直方圖Fig.1 Frequency histograms of leaf area in hybrids

葉片模型標(biāo)志點在PC1 空間中的分布（圖3）顯示，葉片模型標(biāo)志點在PC1 為橫坐標(biāo)軸上的變化幅度大于在PC2 為縱坐標(biāo)軸上的變化幅度，從PC1 軸上可以將大部分個體區(qū)分開。負(fù)向標(biāo)準(zhǔn)差區(qū)域（左邊）葉片輪廓顯示，其葉片小，葉形為菱形，近似于母本小葉楊，而正向標(biāo)準(zhǔn)差區(qū)域（右邊）葉形輪廓顯示，其葉片大，葉形為三角形，近似于父本歐洲黑楊，表明來自不同親本的遺傳效應(yīng)。

圖2 基于LeafAnalyser 軟件葉形變異主成分分析Fig.2 Principal component analysis of leaf shape variation based on LeafAnalyser

2.3 基于MorphoJ 軟件葉形變異的主成分分析

利用MorphoJ 軟件對子代葉片形態(tài)標(biāo)志點進行GPA 分析，結(jié)果（圖4）顯示，去除了來自葉片大小和比例的影響因素（葉片位置和大小的差異），所有葉片最大限度地重合，能夠直觀地反映葉片形態(tài)特征上的差異?；贕PA 分析的葉片輪廓點陣模型圖上，上方為葉基，下方為葉尖，藍(lán)色點為根據(jù)葉片形態(tài)標(biāo)志點構(gòu)建的平均葉的葉形輪廓模型，紅色數(shù)字為標(biāo)志點的序號。

基于GPA 分析葉片標(biāo)志點的葉形輪廓（圖5）顯示，PC1 的葉形變化主要由葉長和葉寬決定，葉基和葉尖標(biāo)志點的變化趨勢為外延（葉片長度增大），葉片兩側(cè)葉緣標(biāo)志點的變化趨勢為內(nèi)收（葉片寬度減小）；PC2 的葉形變化主要由葉尖、葉基及兩側(cè)葉緣的形態(tài)決定，葉尖和葉基兩側(cè)葉緣標(biāo)志點的變化趨勢為外延，葉基和葉尖兩側(cè)葉緣標(biāo)志點的變化趨勢為內(nèi)收；PC3 的葉形變化主要由葉尖方向決定，葉尖標(biāo)志點的變化趨勢為葉尖向不同方向偏移，即葉片主脈對稱性的變化趨勢；PC4 的葉形變化主要由葉片上下寬度的形態(tài)決定，葉尖兩側(cè)葉緣標(biāo)志點變化趨勢為外延，其次是葉基兩側(cè)葉緣的標(biāo)志點變化趨勢為內(nèi)斂。

圖3 基于PC1 和PC2 葉形輪廓模型標(biāo)志點分布Fig.3 Distribution of points in leaf shape model based on PC1 and PC2

利用MorphoJ 軟件基于GPA 分析200 個標(biāo)志點數(shù)據(jù)、對子代葉片形態(tài)進行主成分分析，對葉片形態(tài)變化的統(tǒng)計結(jié)果形成了可視化的葉形輪廓圖（圖5），直接構(gòu)建了葉形輪廓，實心點輪廓為標(biāo)準(zhǔn)葉的葉片形態(tài)，短線輪廓為標(biāo)準(zhǔn)葉在該主成分下的變異趨勢，其最終輪廓顯示了對該主成分影響最顯著的葉片形態(tài)，雜交子代標(biāo)準(zhǔn)葉的形態(tài)輪廓介于母本和父本之間。在葉片形態(tài)標(biāo)志點數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果中，PC1 占總變量的50%，PC2 占總變量的19%，PC3 和PC4 分別占總變量的11%和5%，前四個主成分累計占總變量的85%，能夠解釋子代葉片形狀的主要差異。

圖4 基于MorphoJ 軟件疊印法分析葉片形態(tài)點陣模型Fig.4 Leaf shape model of GPA based on procrustes fit of MorphoJ software

圖5 基于MorphoJ 的葉片形態(tài)變異主成分Fig.5 Principal component of leaf shape variation by MorphoJ

3 討論

利用形態(tài)性狀和特征來估測變異是最現(xiàn)實的方法，尤其是當(dāng)要求在短期內(nèi)對變異有所了解或其他生化等方法無法開展時，形態(tài)學(xué)手段可作為一種有價值的選擇方法[23-24]。葉形變異作為葉片性狀研究中的重要組成部分，在遺傳育種、植物分類、系統(tǒng)進化等方面均具有重要的應(yīng)用[25-27]?；趥鹘y(tǒng)測量方法的葉片形態(tài)性狀，大多為葉長、葉寬、葉面積等數(shù)量性狀，難以準(zhǔn)確量化葉片形狀等質(zhì)量性狀，且丟失一些葉片特征，亦無法分離葉形形態(tài)的數(shù)量和質(zhì)量性狀。近年來，基于計算機識別的葉片形態(tài)性狀測量方法被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外葉片形態(tài)性狀變異研究，通過葉形分析軟件研究葉片形態(tài)變異，涉及植物分類、種質(zhì)鑒定等方面，但在楊樹葉片性狀變異研究方面的應(yīng)用未見報道。本研究以小葉楊與歐洲黑楊雜交F1代子代為試材，通過掃描儀和葉片識別軟件精確測定葉片形態(tài)性狀，構(gòu)建了一種全面高效葉片形態(tài)的分析方法，為后續(xù)研究雜交子代中葉片形態(tài)變異提供了一種有效的參考方法。

本研究使用葉形分析軟件LeafAnalyser 和MorphoJ 對小葉楊與歐洲黑楊雜交子代無性系大量葉片形態(tài)性狀進行快速測量，通過葉片形態(tài)標(biāo)志點和普氏疊印法分析（GPA），構(gòu)建了葉片形態(tài)輪廓模型，對葉形變異的主成分分析呈現(xiàn)了可視化的葉形變化，可直觀地確定影響葉形變異的主要特征，并通過葉形輪廓模型圖像探討了子代變異與親本表現(xiàn)之間的聯(lián)系。這種基于標(biāo)志點的葉片形態(tài)分析方法，能夠直觀地反映葉片形態(tài)的特征差異，并能表現(xiàn)出親本的葉片形態(tài)特征對子代的影響，是對經(jīng)典葉形測量和變異分析方法的提升，彌補了傳統(tǒng)性狀測量方法產(chǎn)生的葉形特征不足的情況，在楊樹葉形態(tài)變異及性狀相關(guān)性選擇研究中具有應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)小葉楊與歐洲黑楊雜交F1代無性系葉面積變異豐富，基于葉形分析軟件LeafAnalyser和MorphoJ 的測量實現(xiàn)了葉片形態(tài)性狀精確量化，通過標(biāo)志法和輪廓法，以可視化圖片的形式直觀地闡明了葉片形態(tài)變異，為葉片形態(tài)性狀變異研究提供了方便準(zhǔn)確的應(yīng)用方法。