劉丹丹，楊婧芳，侯林叢，陸 靜，孫世雯，向霞霞

（1.河南海瑞正檢測技術(shù)有限公司，河南鄭州450001；2.安陽市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所）

動(dòng)物源性飼料原料在腐敗過程中，由于酶和細(xì)菌的作用，蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)被稱作揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)[1～4]。此類物質(zhì)具有揮發(fā)性，其含量越高，表明氨基酸被破壞的越多，對產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值影響越大[5～7]。

TVB-N 是評價(jià)動(dòng)物源性飼料原料質(zhì)量和新鮮度的一個(gè)重要指標(biāo)[8～14]，已使用該指標(biāo)在飼料行業(yè)中進(jìn)行評估動(dòng)物性飼料原料及其飼料產(chǎn)品的新鮮度，并且魚粉、肉骨粉、血球粉等飼料原料的國家標(biāo)準(zhǔn)[15～17]中規(guī)定了TVB-N 的限量值，因此TVB-N 項(xiàng)目檢測結(jié)果就顯得尤為重要[4]。本研究通過對TVB-N檢測過程中關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，旨在研究出操作簡單、快捷、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器

樣品粉碎機(jī)（DFY-200C，溫嶺市林大機(jī)械有限公司）、分樣篩（40 目、60 目）、分析天平（感量0.1mg）、數(shù)控超聲波清洗器（KQ-250DE 型，昆山市超聲儀器有限公司）、搖床（SHA-C）、電爐、離心機(jī)（JW-1042，安徽嘉文儀器裝備有限公司）、酸式滴定管（最小分度值為0.1mL）、錐形瓶（250mL）、容量瓶（50mL）、定氮裝置。

1.1.2 試劑

水（符合GB/T 6682 中三級用水的要求）、高氯酸溶液（0.1mol/L、0.6mol/L、1.2 mol/L）、氫氧化鈉溶液（40g/L）、鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01mol/L）、硼酸吸收液（10g/L）、硅油消泡劑、(NH4)2SO4溶液、混合指示劑（甲基紅0.1%乙醇溶液與溴甲酚綠0.5%乙醇溶液等體積混合，臨用前配制）、甲基紅指示劑（10g/L）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集和制備

按照GB/T 14699.1 要求抽取有代表性的飼料原料樣品，用四分法縮減取樣，按照GB/T 20195 制備樣品，粉碎后，分別過40 目、60 目分析篩，混勻，裝入磨口瓶中備用。

1.2.2 樣品處理

稱取試樣5g（精確至0.1mg）于錐形瓶中，分別加浸提試劑40mL，浸提后，將試樣及試樣浸提液完全轉(zhuǎn)移至50mL 容量瓶，并用浸提液定容，搖勻；取約30mL 試樣浸提液于50mL 離心管中，離心（3 500r/min）5min，取上清液待測（如不能及時(shí)檢測，于2℃-6℃的條件下貯存，可保存24h）。

1.2.3 定氮操作

取硼酸吸收液30mL 注入錐形瓶內(nèi)，加混合指示劑3 滴，并將錐形瓶置于半微量定氮器冷凝管下端，使其下端插入硼酸吸收液的液面下。吸取浸提上清液10mL，注入半微量定氮器反應(yīng)室內(nèi)，于蒸汽發(fā)生裝置加入甲基紅指示劑2 滴，在樣品反應(yīng)裝置中加入硅油消泡劑2 滴和氫氧化鈉溶液10mL，然后迅速加塞，并加水密封，防止漏氣。通入蒸汽進(jìn)行蒸餾，當(dāng)餾出液達(dá)到150mL 左右時(shí)，將冷凝管末端離開吸收液面，繼續(xù)蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液并入錐形瓶內(nèi)，然后停止蒸餾。

1.2.4 滴定

用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)，同時(shí)，用浸提試劑10mL 代替浸提上清液進(jìn)行空白試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同粉碎粒度對檢測效果的影響

分別取未粉碎、粉碎過40 目篩和60 目篩的試樣，按上述檢測步驟進(jìn)行分析，每種處理情況測試5個(gè)平行樣品。測試結(jié)果見表1。由表1 可知，未粉碎處理的樣品與粉碎過40 目篩、60 目篩樣品相比存在顯著差異(P＜0.05)；而粉碎至40 目、60 目時(shí)樣品處理間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 不同浸提試劑對檢測效果的影響

表1 不同粉碎粒度對揮發(fā)性鹽基氮檢測結(jié)果的影響

在確定了樣品粉碎粒度為40 目的基礎(chǔ)上，研究比較了不同濃度的高氯酸溶液（0.1mol/L、0.6mol/L、1.2 mol/L）對試樣中TVB-N 的提取效果，每種處理情況測試5 個(gè)平行樣品，其結(jié)果如表2所示。

由表2 可知，隨著高氯酸溶液濃度的增加，樣品浸提液的pH 值逐漸降低，可能存在的微生物和酶活性繼續(xù)腐敗受到抑制，TVB-N 值呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。但提取試劑濃度為0.6mol/L 與1.2 mol/L 樣品提取液pH 值均在2.0 以下，且測定的TVB-N 含量比較穩(wěn)定，說明TVB-N 的提取達(dá)到了很好的效果。但從實(shí)驗(yàn)室安全性、節(jié)約成本及環(huán)境友好角度考慮，本研究選擇0.6 mol/L 高氯酸溶液作為提取劑。

表2 不同浸提試劑對揮發(fā)性鹽基氮檢測結(jié)果的影響

2.3 不同浸提方式和時(shí)間對檢測效果的影響

在確定了樣品粉碎粒度為過40 目篩，浸提試劑為0.6 mol/L 高氯酸溶液基礎(chǔ)上，研究比較了不同浸提方式（超聲浸提、振搖浸提）和時(shí)間（10min、20min、30min、40min）對試樣中TVB-N 的提取效果，其結(jié)果如表3 所示。

結(jié)果表明，超聲波浸提20min 與超聲波浸提30min、振搖浸提30min 或振搖浸提40min 測得樣品中TVB-N 含量差異不顯著(P＞0.05)。因此，考慮到節(jié)約時(shí)間成本，提高浸提效率，超聲波浸提20min比較合適。

表3 不同浸提方式及時(shí)間對揮發(fā)性鹽基氮檢測結(jié)果的影響

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

2.4.1 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取一定濃度(NH4)2SO4溶液加入魚粉、豬肉粉及雞肉粉中，測定試樣中TVB-N 的含量，每個(gè)梯度重復(fù)測定5 次，結(jié)果見表4。測定的加標(biāo)回收率在95.11%～105.45%之間，符合檢測要求。

2.4.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

分別取魚粉、豬肉粉及雞肉粉樣品，測定試樣中TVB-N 的含量，每個(gè)樣品重復(fù)測定5 次，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，該檢測方法重現(xiàn)性好，滿足測定要求。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表5 精密度測定結(jié)果

3 討論

3.1 不同粉碎粒度對檢測效果的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，動(dòng)物源性飼料原料的粉碎粒度對試樣中TVB-N 的測定結(jié)果影響較大，未粉碎處理的樣品與粉碎過40 目篩、60 目篩樣品中TVB-N 的測定結(jié)果相比存在顯著差異(P＜0.05)，原因?yàn)榉鬯榈臉悠放c浸提試劑接觸面積更大，提高了TVB-N 的浸提效率，使檢測結(jié)果更能體現(xiàn)樣品本身的TVB-N 含量；而粉碎至40 目與60 目時(shí)樣品處理間差異不顯著(P＞0.05)，說明粉碎至40 目時(shí)，樣品在浸提之后測定的TVB-N 的結(jié)果已經(jīng)相對可靠，能夠體現(xiàn)樣品本身的新鮮度，該研究結(jié)果與Wang等[10]研究結(jié)果一致。因此，動(dòng)物源性飼料原料中TVB-N 的數(shù)值與樣品的粉碎粒度密切相關(guān)，粉碎粒度達(dá)到一定程度，有利于TVB-N 的測定。

3.2 不同浸提試劑對檢測效果的影響

研究表明，提取試劑的濃度對試樣中TVB-N的測定結(jié)果具有一定的影響。本試驗(yàn)采用0.6mol/L高氯酸溶液作為浸提試劑的原因：一是該試劑可以有效沉淀物源性飼料原料中的蛋白質(zhì)，有效防止樣品中蛋白質(zhì)對測定結(jié)果的干擾；二是該試劑pH 較低，對酶活有一定的抑制作用，同時(shí)具有殺菌和抑菌作用，因此，可以延長待測液保存時(shí)間，還可以有效降低由于細(xì)菌或酶對樣液中蛋白質(zhì)的分解對TVB-N 檢測結(jié)果的影響。該研究結(jié)果與季天榮等[4]研究結(jié)果一致，因此，該試劑在一定程度上能保證檢測結(jié)果的可靠性。

3.3 不同浸提方式和時(shí)間對檢測效果的影響

研究表明，不同浸提方式和浸提時(shí)間對檢測結(jié)果有一定的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波浸提20min與超聲波浸提30min、振搖浸提30min 或振搖浸提40min 測得樣品中TVB-N 含量差異不顯著(P＞0.05)。本研究采用超聲波浸提20min 進(jìn)行提取，不僅節(jié)約了時(shí)間，提高了工作效率，同時(shí)也有效防止因浸提時(shí)間過長，導(dǎo)致樣品在浸提過程中產(chǎn)生的進(jìn)一步腐敗，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.4 準(zhǔn)確度和精密度

本試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化后的檢測方法測定的魚粉、豬肉粉、雞肉粉中TVB-N 的加標(biāo)回收率及變異系數(shù)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。主要原因：一是在樣品處理時(shí)，優(yōu)化法將樣品粉碎達(dá)到過40 目篩的標(biāo)準(zhǔn)，選用0.6 mol/L 高氯酸溶液作為浸提劑，提高了樣品與浸提劑的接觸面積，提高了TVB-N 的溶出效率，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度、可靠性；二是采用超聲波浸提的方式，提高了浸提效率，縮短了提取時(shí)間，減少了試驗(yàn)過程中的前處理因素給試驗(yàn)結(jié)果帶來的影響，進(jìn)一步提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過優(yōu)化動(dòng)物源性飼料原料中揮發(fā)性鹽基氮的含量測定過程中的關(guān)鍵參數(shù)，確定了試樣達(dá)到過40 目篩的粉碎程度、浸提液選取0.6 mol/L高氯酸溶液、超聲波浸提20min 時(shí)，試樣中的揮發(fā)性鹽基氮的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。研究表明，該操作方法簡便、快速，有很高的準(zhǔn)確度和精密度，適宜于大批量樣品的處理與檢測，應(yīng)用前景廣闊。