寧舒婷 張海英 耿國興 王映飛 黃而弘 李敏清

(廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院 1 婦產(chǎn)科，2 B超科，南寧市 530021，電子郵箱：810104953@qq.com；廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院 3 遺傳代謝中心，4 放射科， 南寧市 530002；5 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷與遺傳病診斷科，南寧市 530021)

隨著我國女性初次生育年齡逐漸增大及二胎政策的全面實施，出生缺陷率呈逐年上升趨勢[1]。神經(jīng)系統(tǒng)畸形是胎兒時期較常見的先天異常，患病率為0.14%～0.16%[2]。神經(jīng)系統(tǒng)畸形包括顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常與脊柱結(jié)構(gòu)異常，其中顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常是神經(jīng)系統(tǒng)畸形的主要類型，種類較多，包括神經(jīng)管缺陷(無腦畸形、露腦畸形、腦膨出及腦膜膨出)、腦積水和腦室擴張、胼胝體發(fā)育不全、Dandy-Walker綜合征、前腦無裂畸形、脈絡(luò)叢囊腫等。

研究表明，胎兒神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常與染色體病(數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)畸變)關(guān)系密切，尤其是18-三體和13-三體[3]。在過去40年里，胎兒神經(jīng)系統(tǒng)畸形的遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷方法主要是經(jīng)典的顯帶核型分析。然而，傳統(tǒng)的顯帶核型分析不能發(fā)現(xiàn)小于5 Mb的染色體異常，不能識別染色體微缺失和微重復(fù)。Hultén等[4]研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的染色體核型分析只能檢出15%～40%的染色體異常。在臨床中，我們也時常發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的染色體核型分析未發(fā)現(xiàn)異常的胎兒結(jié)構(gòu)畸形病例，往往隱藏著亞顯微基因組拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)，而微缺失和微重復(fù)變化常與胎兒發(fā)育異常相關(guān)。近年來新興發(fā)展的高分辨率染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA)，通過對基因組CNV的檢測分析，可檢出50～100 kb的CNV，并能識別常規(guī)染色體核型分析不能發(fā)現(xiàn)的微缺失或微重復(fù)，額外發(fā)現(xiàn)6%～15%的染色體細微變異，對染色體亞微結(jié)構(gòu)異常進行診斷，突破了傳統(tǒng)核型分析的技術(shù)局限性。此外，CMA無須組織或細胞培養(yǎng)，可避免母體污染，檢測所需時間短，是分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)的革命性發(fā)展[5]。CMA檢測能顯著提升染色體疾病檢出能力[5-8]，實現(xiàn)產(chǎn)前診斷的精確化，在以胎兒超聲異常為主的產(chǎn)前診斷中有著重要的臨床意義。目前，CMA單獨應(yīng)用于胎兒顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常診斷的大數(shù)據(jù)研究罕見報告。因此，本研究對121例超聲診斷存在胎兒顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常的病例進行回顧性分析，比較其染色體核型分析及CMA的檢測結(jié)果，探討產(chǎn)前CMA在胎兒顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月至2018年7月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科門診或優(yōu)生遺傳科就診的121例胎兒顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常病例，回顧性分析其臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：孕期胎兒超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)胎兒存在脊柱結(jié)構(gòu)異常；(2)孕婦認知功能障礙；(3)孕婦隨訪不確定者。孕婦年齡17～44歲，孕周17～34周。

1.2 超聲檢查方法 使用日本東芝Aplio 400型彩色多普勒超聲診斷儀，二維凸陣探頭頻率為3.5～5.0 MHz。受檢孕婦取仰臥位，超聲檢查切面包括:丘腦、側(cè)腦室、小腦切面，脊柱縱切面，鼻骨矢狀正中切面，眶間距切面，顏面冠狀切面，四腔心、左右心室流出道觀、三血管觀，主動脈弓切面、導(dǎo)管弓切面，腹圍切面，膀胱旁臍動脈切面，雙腎橫切面及縱切面，雙上肢肱骨、尺橈骨、雙下肢股骨、脛腓骨縱切面等。同時觀察羊水、臍帶及胎盤情況。

1.3 G顯帶核型分析及CMA檢測方法

1.3.1 取材：孕婦充分知情并簽署同意書，經(jīng)排除手術(shù)禁忌證后獲取胎兒細胞。其中，孕17～22周孕婦選擇經(jīng)腹羊膜腔穿刺術(shù)獲取羊水，孕周>22周者選擇經(jīng)皮臍靜脈穿刺術(shù)獲取臍血標(biāo)本。獲取的標(biāo)本均分為兩份。

1.3.2 染色體核型分析方法：取其中一份標(biāo)本制備染色體。其中羊水標(biāo)本以1 500 r/min離心8 min，棄上清液。因雙人雙線培養(yǎng)，沉淀物被分為2份，同時接種于美國Irvine Scientific公司和廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥公司生產(chǎn)的兩種羊水細胞培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d；在Olympus CKX31倒置顯微鏡(日本Olympus 公司)下觀察細胞生長情況，待細胞貼壁并生長至7～8個較大克隆時，加秋水仙素終止細胞與分裂中期，采用胰酶消化法收獲培養(yǎng)的羊水細胞，1 800r/min離心8 min收獲細胞沉淀。臍血標(biāo)本送實驗室后，也需雙人雙線培養(yǎng)，標(biāo)本分別接種于廣州達暉生物醫(yī)藥公司和廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥公司生產(chǎn)的2種淋巴細胞培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68～72 h后，加秋水仙素終止細胞于分裂中期，1 800 r/min離心8 min收獲臍帶血細胞沉淀。對羊水或臍帶血細胞沉淀依次行固定3次[用0.075%氯化鉀、3 ∶1(甲醇 ∶乙酸)的固定劑]、滴片、顯帶、染色，然后采用G顯帶核型分析技術(shù)，均采用德國蔡司染色體分析軟件進行核型分析，常規(guī)計數(shù)20個核分裂象，分析其中5個核型。若發(fā)現(xiàn)異常嵌合體核型，則將計數(shù)與分析增加至50個核分裂象。根據(jù)2013版《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制》(ISCN2013)[9]，對檢出的染色體核型進行命名。

1.3.3 CMA方法：取另一份標(biāo)本，采用廈門致善生物科技有限公司生產(chǎn)的Lab-Aid 820核酸提取Midi試劑盒(批號：200116)，按試劑盒說明書進行DNA提取，DNA質(zhì)檢操作標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)Human Cyto SNP-12 300K微陣列芯片(美國Illumina公司)操作手冊執(zhí)行。檢測流程包括DNA定量，全基因組擴增，DNA片段化，沉淀、重懸DNA片段，DNA與芯片雜交，芯片清洗，單堿基延伸及染色，包被芯片。用Illumina iScan激光共聚焦掃描儀對雜交后的芯片進行掃描，數(shù)據(jù)結(jié)果使用KaryoStudioV1.4.3.0軟件進行分析。查閱常用數(shù)據(jù)庫[Clingene(https：//www.clinicalgenome.org)、ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)、DECIPHER(https：//decipher.sanger.ac.uk)、DGV(http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home)和OMIM(http：//omim.org)等]及PubMed數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)，對檢出異常CNV及嵌合情況進行分析。CNV的致病性按美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會制定的相關(guān)致病性判讀指南[10]進行判讀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 121例顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常胎兒的染色體核型分析結(jié)果 121例顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常的胎兒中，核型正常 110例，占90.9%；染色體核型異常11例，檢出率為9.1%，其中致病性染色體異常(非整倍體異常、非平衡性結(jié)構(gòu)異常核型)7例(5.8%)。在11例染色體核型異常的病例中，染色體數(shù)目異常共 4例(21-三體綜合征1例、18-三體綜合征1例、胎兒標(biāo)記染色體1例、9號染色體短臂四體并性染色體嵌合異常1例)，染色體結(jié)構(gòu)異常共7例(平衡易位1例、臂間倒位2例、大片段缺失2例、大片段重復(fù)2 例)，見表1。

表1 11例染色體異常胎兒的顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常表現(xiàn)、CMA結(jié)果及臨床結(jié)局

2.2 顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常胎兒的CMA結(jié)果 121例胎兒中，26例檢出CNV，檢出率為21.5%，其中致病性CNV共15例，檢出率為 12.4%，意義不明確的變異(variants of unknown significance，VOUS)共 11例，檢出率為9.1%。CMA對致病性CNV的檢出率(12.4%)與染色體核型分析的致病性染色體檢出率(5.8%)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.450，P=0.118)，但針對致病性染色體異常，CMA較傳統(tǒng)的核型分析額外增加了6.6%的檢出率。

15例致病性CNV中，非整倍體染色體異常3例，均與染色體核型G顯帶結(jié)果一致；染色體大片段缺失1例，染色體核型分析提示46，XN,del(5)(p14)；部分缺失部分重復(fù)1例，染色體核型分析提示46，XN,del(18)(q22q23)；染色體大片段重復(fù)2例，染色體核型分析分別為46，XX,der(2)t(2;7)(q37;q22)和46，XN，der(7)t(2；7)(p23；q35)；微缺失微重復(fù)8例，染色體核型分析均正常。見表2。

表2 15例致病性CNV胎兒的CMA及染色體核型檢測結(jié)果、顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常表現(xiàn)、臨床結(jié)局

15例致病性CNV中，7例為明確的微缺失/微重復(fù)綜合征及致病性綜合征，分別是貓叫綜合征、16p13.11微缺失綜合征、Wolf-Hirschhorn綜合征、Smith-Magenis綜合征、21-三體綜合征、18-三體綜合征,1q21.1微缺失綜合征;其余8例所包含的致病性 CNV，在DECIPHER 數(shù)據(jù)庫中已有較多變異報告，并存在臨床表型及導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)畸形的致病基因。15例致病性CNV經(jīng)隨訪，均通過引產(chǎn)終止妊娠。

3 討 論

染色體亞顯微層面結(jié)構(gòu)異常引發(fā)的出生缺陷，臨床表型的嚴重性不亞于染色體顯微層面上數(shù)目或者結(jié)構(gòu)異常，而CMA技術(shù)的革命性發(fā)展，為檢測這種亞顯微染色體異常提供了一種新方法。Wapner等[5]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用CMA 進行檢測可以較常規(guī)核型分析多發(fā)現(xiàn)6%的病理意義拷貝。 Sun等[11]對46例胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常但染色體核型分析正常的孕婦進一步行 CMA檢測，發(fā)現(xiàn)在37.0%的病例中檢測到 CNV，10.9%的胎兒有致病性 CNV。此外，有研究表明，在染色體核型分析判定為平衡易位樣本中，有7.9%的樣本在斷裂連接處存在CNV[12]。因此，應(yīng)用 CMA 技術(shù)可同時了解遺傳物質(zhì)數(shù)量是否發(fā)生增減，為胎兒去留的選擇提供重要依據(jù)[12]。

本研究中，采用CMA共檢出致病性CNV 15例(檢出率為12.4%)，其中7例為明確的微缺失/微重復(fù)綜合征及致病性綜合征，8例所包含的致病性 CNV存在臨床表型及導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)畸形的致病基因，經(jīng)隨訪均通過引產(chǎn)終止妊娠。而染色體核型分析檢出核型異常11例(檢出率為9.1%)，其中致病性染色體異常(非整倍體異常、非平衡性結(jié)構(gòu)異常核型)僅7例(5.8%)。雖然兩種技術(shù)的致病性染色體異常檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但針對致病性染色體異常，CMA仍較傳統(tǒng)的染色體核型分析額外增加了6.6%的檢出率，CMA檢出的8例微缺失/微重復(fù)，其染色體核型分析均正常。額外發(fā)現(xiàn)的這8例致病性CNV，如果只進行傳統(tǒng)的核型分析，有可能會因為所謂的“金標(biāo)準(zhǔn)”無異常選擇繼續(xù)妊娠，在后續(xù)的檢查發(fā)現(xiàn)更嚴重的異常而影響臨床干預(yù)時機。由此可見，針對影像學(xué)檢查提示胎兒顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常的孕婦，即使傳統(tǒng)核型分析提示結(jié)果正常，行CMA分析也是必要的，其可為評估胎兒預(yù)后提供更多信息，有利于遺傳咨詢及再發(fā)風(fēng)險的評估，并可進一步減少活產(chǎn)兒嚴重出生缺陷的發(fā)生。此外，在本研究的11例提示染色體異常的胎兒中，有1例胎兒標(biāo)記染色體CMA未檢出異常，隨訪時孕婦拒接電話，胎兒結(jié)局失訪，3例為平衡易位的胎兒CMA 結(jié)果均未見異常，隨訪均正常分娩，嬰兒生長發(fā)育正常。由此可見，染色體核型異常的胎兒，由于遺傳物質(zhì)數(shù)量未發(fā)生增減，微陣列芯片結(jié)果可正常，這對于胎兒去留的選擇有著重要的參考意義。然而，微陣列技術(shù)也存在局限性，其不能檢測出拷貝數(shù)沒有變化的染色體異常，如染色體平衡性結(jié)構(gòu)改變(相互易位、倒位、插入)，而此類染色體物質(zhì)的平衡與重排對目前妊娠雖沒有影響，卻與未來的生殖咨詢有關(guān)。

總之，對存在顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常的胎兒，CMA較傳統(tǒng)核型分析可提供更多臨床信息，對胎兒結(jié)局的評估有著重要意義。故當(dāng)產(chǎn)前檢查發(fā)現(xiàn)胎兒顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常時，應(yīng)產(chǎn)前同時行染色體核型分析及CMA分析。