張婷睿 余宏杰 陳秋桐 劉明威 何啟強(qiáng),2

[1 武漢大學(xué)健康學(xué)院，湖北省武漢市 430071，電子郵箱：1184820889@qq.com；2 湖北生物質(zhì)資源化學(xué)與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(武漢大學(xué))，湖北省武漢市 430071]

葉酸是水溶性B族維生素的一種[1]，參與甲基的傳送、體內(nèi)氨基酸及核酸合成，也是胚胎發(fā)育所需的重要營(yíng)養(yǎng)素，其無法自身合成而依賴于外源性攝取與補(bǔ)充。孕期葉酸的生理需要量明顯升高，這導(dǎo)致孕婦成為葉酸缺乏的高危人群[2]。早期母體葉酸攝入不足，會(huì)導(dǎo)致孕婦高同型半胱氨酸血癥、低出生體重、早產(chǎn)等多種不良母嬰結(jié)局[3]。而葉酸缺乏癥狀與葉酸補(bǔ)充不足和葉酸代謝障礙有關(guān)[4]，其中引起葉酸代謝障礙的主要因素是葉酸代謝途徑中甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase,MTRR)和5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)的等位基因發(fā)生突變，導(dǎo)致代謝酶活性降低[5]。因此，外源性的葉酸片劑成為妊娠期葉酸缺乏癥的主要補(bǔ)充措施。為此，世界衛(wèi)生組織和許多國(guó)家衛(wèi)生組織不斷在制定和完善葉酸補(bǔ)充劑量和強(qiáng)化葉酸飲食的建議。1991～1992年，英國(guó)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)和匈牙利國(guó)家衛(wèi)生研究所提出，婦女每日補(bǔ)充小劑量葉酸對(duì)于降低孕期同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平和對(duì)母嬰不良結(jié)局有一定預(yù)防作用[6-7]。2016年，中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)婦幼分會(huì)建議妊娠前3個(gè)月及整個(gè)孕期應(yīng)補(bǔ)充400 μg/d的葉酸，每日不超過1 mg[8]。本研究依據(jù)葉酸代謝MTHFR、MTRR等位基因突變引起的葉酸代謝障礙程度，對(duì)適齡備孕婦女進(jìn)行葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)評(píng)估，從而進(jìn)行個(gè)體化葉酸補(bǔ)充，觀察其血清葉酸、Hcy變化以及胎兒結(jié)局，旨在進(jìn)一步為備孕婦女和妊娠婦女提供更科學(xué)、有效的葉酸補(bǔ)充方案和合理補(bǔ)充葉酸的劑量。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2018年7月至2019年8月于荊州某醫(yī)院門診或住院部進(jìn)行孕前檢查的1 134例婦女。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均為健康適齡備孕婦女，且妊娠后在該院進(jìn)行產(chǎn)檢，無妊娠合并癥；(2)無不良孕產(chǎn)史；(3)體質(zhì)指數(shù)在正常范圍內(nèi)，即18.5 kg/m2≤體質(zhì)指數(shù)<23.9 kg/m2。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有糖尿病、高血壓、甲狀腺疾病、惡性疾病或免疫系統(tǒng)疾病等；(2)有吸煙史及飲酒史，或家人有吸煙史；(3)夫妻雙方有遺傳病史；(4)近期服用過拮抗葉酸和Hcy代謝的藥物。本研究已經(jīng)該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組婦女均自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 葉酸代謝障礙遺傳檢測(cè)： 用棉拭子采集婦女口腔黏膜細(xì)胞，采用QIAGEN公司DNA提取試劑盒(批號(hào)：69504)提取DNA,按試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用TaqMan-MGB探針試劑盒(美國(guó)ABI公司)，7900型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，檢測(cè)MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)的基因型。TaqMan-MGB探針試劑盒探針檢測(cè)序列見表1，其包含MTHFR基因rs1801133和rs1801131位點(diǎn)、MTRR基因rs1801394位點(diǎn)的特異性引物(序列見表2)，熒光探針以及TaqManTMUniversal Master Mix等成分。反應(yīng)體系總體積共10 μL，包括20 ng/μL的DNA模板1 μL、2×TaqManTMUniversal Master Mix 5 μL、上下游引物分別0.2 μL、20×TaqMan-MGB探針0.1 μL、去離子水3.5 μL。反應(yīng)步驟為95℃ 10 min，92℃ 15 s、60℃ 1 min擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)，89℃ 15 s、60℃ 90 s擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。所有步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

表1 TaqMan-MGB探針檢測(cè)探針?biāo)诘奈恢?/p>

表2 引物序列

1.2.2 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：利用SDS 2.3分析軟件確定各樣本的基因分型結(jié)果并進(jìn)行葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)評(píng)估。根據(jù)MTHFR、MTRR等位基因檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)[9]評(píng)估，分為未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)、低度風(fēng)險(xiǎn)、中度風(fēng)險(xiǎn)和高度風(fēng)險(xiǎn)4個(gè)等級(jí)。

1.2.3 葉酸補(bǔ)充方案： 未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)組和低度風(fēng)險(xiǎn)組推薦孕前3個(gè)月和孕期前3個(gè)月補(bǔ)服0.4 mg/d劑量的葉酸，中度風(fēng)險(xiǎn)組推薦孕前3個(gè)月和整個(gè)孕期補(bǔ)服0.4 mg/d劑量的葉酸，高度風(fēng)險(xiǎn)組推薦孕前3個(gè)月和整個(gè)孕期補(bǔ)服葉酸0.8 mg/d劑量的葉酸。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)：按推薦葉酸劑量按時(shí)服用3個(gè)月后，采集婦女靜脈血5 mL，放入抗凝真空采血管，3 500 r/min離心15 min，取上清液。使用4000PLUS全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司),采用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清葉酸,正常參考值范圍為7.0～46.4 nmol/L。采用 AU5400全自動(dòng)快速免疫分析儀(日本Olympus公司)測(cè)定血清Hcy，正常參考值范圍為5～15 μmol/L。所有實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.5 資料收集：收集所有研究對(duì)象的臨床資料，包括年齡、民族、文化程度、職業(yè)。

1.2.6 隨訪： 為了解個(gè)體化葉酸補(bǔ)充對(duì)孕婦的血清Hcy水平和妊娠結(jié)局的影響，葉酸干預(yù)后繼續(xù)對(duì)183名孕婦隨訪12個(gè)月，檢測(cè)其孕早期血清Hcy水平，記錄其分娩時(shí)孕周、新生兒出生時(shí)體重及出生缺陷情況。其中，早產(chǎn)定義為孕周小于37周出生的活產(chǎn)兒；低出生體重定義為新生兒出生體重<2 500 g；出生缺陷包括先天性心臟病、唐氏綜合征、神經(jīng)管畸形(脊柱裂、無腦等)、唇腭裂等先天性疾病。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 1 134名婦女的葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)及人口學(xué)特征資料 1 134名備孕婦女中，未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)385例，低度風(fēng)險(xiǎn)105例，中度風(fēng)險(xiǎn)387例和高度風(fēng)險(xiǎn)257例。人口學(xué)特征資料見表3。

表3 不同葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)婦女人口學(xué)特征資料

2.2 個(gè)體化葉酸補(bǔ)充前后備孕婦女的血清葉酸和Hcy水平變化 通過個(gè)體化葉酸補(bǔ)充后，各葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等級(jí)備孕婦女的血清葉酸及Hcy水平均能維持在正常范圍，且與補(bǔ)充前比較，各風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的葉酸水平上升，低度風(fēng)險(xiǎn)、中度風(fēng)險(xiǎn)、高度風(fēng)險(xiǎn)的Hcy水平下降(均P<0.05)，見表5。

表5 不同葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)備孕婦女個(gè)體化葉酸補(bǔ)充前后血清葉酸和Hcy水平(x±s)

2.3 個(gè)體化葉酸補(bǔ)充后備孕婦女血清葉酸與Hcy水平的相關(guān)性 個(gè)體化葉酸補(bǔ)充后，各風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的備孕婦女血清葉酸與Hcy水平均呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，見表6。

表6 個(gè)體化葉酸補(bǔ)充不同葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)備孕婦女血清葉酸與Hcy水平的相關(guān)性

2.4 不同葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)間產(chǎn)婦孕期血清Hcy水平及妊娠結(jié)局 繼續(xù)隨訪的183名孕婦葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)孕婦49例，低度風(fēng)險(xiǎn)孕婦13例，中度風(fēng)險(xiǎn)孕婦64例和高度風(fēng)險(xiǎn)孕婦57例。所有風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)孕婦孕早期(12.26±1.21)周血清Hcy水平均在正常范圍內(nèi)，均未出現(xiàn)高Hcy血癥；高度風(fēng)險(xiǎn)組有1(1.75%)例早產(chǎn)兒，中度風(fēng)險(xiǎn)組中有1(1.56%)例低體重產(chǎn)兒；均無出生缺陷新生兒。見表7。

表7 不同葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)產(chǎn)婦孕早期血清Hcy水平、產(chǎn)期及新生兒出生體重(x±s)

3 討 論

葉酸多存在于天然蔬菜中，烹飪時(shí)容易受熱分解，并且不易被人體吸收。天然的葉酸需要通過小腸黏膜的作用被水解為單谷氨酸葉酸后才能被人體吸收[10]。葉酸補(bǔ)充劑通常為蝶酰谷氨酸，是葉酸代謝產(chǎn)物[11]。葉酸缺乏主要可導(dǎo)致典型的巨幼紅細(xì)胞貧血，引起MTHFR、MTRR基因活化和修復(fù)異常，導(dǎo)致抑癌基因失衡，與各種癌癥疾病有關(guān)[12]。由于營(yíng)養(yǎng)攝入不均衡或葉酸代謝障礙等原因，妊娠期更容易出現(xiàn)葉酸攝入不足。孕期葉酸缺乏容易出現(xiàn)先兆子癇、胎盤早剝和自發(fā)性流產(chǎn)等，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、早產(chǎn)和新生兒體重偏低，還會(huì)增加胎兒先天性心臟病、唐氏綜合征、神經(jīng)管畸形(脊柱裂、無腦等)、唇腭裂等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[13]。葉酸的吸收不僅與葉酸代謝酶活性有關(guān)，還與種族、民族、飲食習(xí)慣和個(gè)體差異有關(guān)[14]?；加刑悄虿?、甲狀腺疾病以及肥胖癥的妊娠婦女，補(bǔ)充應(yīng)當(dāng)劑量的葉酸無法達(dá)到補(bǔ)充葉酸的效果[15]；而補(bǔ)充高劑量的葉酸，往往會(huì)掩蓋因維生素B12缺乏而引起的神經(jīng)性貧血癥或直腸癌[16]。因此，通過葉酸代謝障礙遺傳檢測(cè)以判斷葉酸的利用能力，從而進(jìn)行個(gè)體化葉酸補(bǔ)充具有重要意義。

本研究依據(jù)葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)評(píng)估，對(duì)備孕婦女葉酸代謝情況進(jìn)行分級(jí)，按照風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)給予葉酸補(bǔ)充的個(gè)體化指導(dǎo)意見，結(jié)果顯示，通過個(gè)體化葉酸補(bǔ)充后，各風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)備孕婦女的血清葉酸水平不僅能維持在正常范圍，且較補(bǔ)充前更高(P<0.05)，初步體現(xiàn)了葉酸補(bǔ)充的效果。研究表明,MTHFR和MTRR還原酶等位基因的突變會(huì)導(dǎo)致葉酸代謝障礙，造成葉酸代謝紊亂，同時(shí)還影響Hcy水平[17];在低葉酸水平的環(huán)境下,MTHFR和MTRR還原酶等位基因的突變者血Hcy濃度可顯著升高,而高Hcy會(huì)引起靜脈栓塞,從而導(dǎo)致早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局[18]。有研究表明，妊娠期婦女補(bǔ)充葉酸，短期內(nèi)可使血清葉酸水平升高，可調(diào)控蛋氨酸循環(huán)通路，降低血清Hcy水平，進(jìn)而有效地減少妊娠高血壓癥、糖尿病以及不良妊娠等事件[19]。在本研究中，采用個(gè)體化葉酸補(bǔ)充后，隨著血清葉酸水平的升高，低度風(fēng)險(xiǎn)、中度風(fēng)險(xiǎn)、高度風(fēng)險(xiǎn)備孕婦女的血清Hcy水平有所下降，相關(guān)性分析也進(jìn)一步證實(shí)血清葉酸與Hcy水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；此外，接受隨訪的備孕婦女孕早期血清Hcy水平均在正常范圍內(nèi)，未出現(xiàn)高Hcy血癥?？傊?，不同葉酸利用率評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)備孕婦女通過個(gè)體化的葉酸補(bǔ)充，不僅可提高血清葉酸水平，同時(shí)還可降低血清Hcy含量，有效地預(yù)防妊娠期高Hcy血癥。

低血清葉酸水平、高Hcy血癥與不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)，通常會(huì)導(dǎo)致胎兒多神經(jīng)管缺陷、先天性心臟缺陷、低出生體重、早產(chǎn)等多種不良事件[20]。賴毓冕[21]發(fā)現(xiàn)，新生兒出生體重受孕期母體血 Hcy 水平影響，孕婦血漿 Hcy 水平升高會(huì)顯著增加分娩小于胎齡兒的危險(xiǎn)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，葉酸代謝基因的多態(tài)性或缺失與自發(fā)性早產(chǎn)有關(guān)，攝入葉酸補(bǔ)充劑或食物來源葉酸可以減少早產(chǎn)的發(fā)生[22]。李楠等[23]發(fā)現(xiàn)，圍孕期或孕期補(bǔ)充低劑量葉酸的孕產(chǎn)婦可提高產(chǎn)兒體重。在本研究183例樣本的隨訪中，僅發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒與低出生體重兒各1例，且未發(fā)現(xiàn)出生缺陷產(chǎn)兒。這提示個(gè)體化葉酸補(bǔ)充對(duì)于預(yù)防新生兒不良結(jié)局有一定的作用。

綜上所述，根據(jù)葉酸代謝MTHFR、MTRR等位基因突變引起的葉酸代謝障礙程度評(píng)估葉酸利用率風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，再進(jìn)行備孕期個(gè)體化葉酸補(bǔ)充，可以短期內(nèi)提高血清葉酸的濃度，并且控制血清Hcy水平，可預(yù)防因葉酸缺乏或高Hcy血癥而引起的新生兒不良結(jié)局。本研究存在一定的局限性：納入人群區(qū)域性較強(qiáng)，個(gè)體差異性較大，橫斷面研究不能確定其因果關(guān)系，還應(yīng)與非個(gè)性補(bǔ)充效果相比較等。此外，由于我國(guó)國(guó)土面積廣大，各地飲食習(xí)慣的不同，例如南北飲食差異明顯，北方飲食中新鮮水果蔬菜攝入較少，葉酸攝入平均水平低于南方，還應(yīng)細(xì)化葉酸補(bǔ)充指導(dǎo)方案，將基因檢測(cè)和飲食習(xí)慣相結(jié)合，從遺傳因素、飲食方式、運(yùn)動(dòng)方式和生活方式等方面，在備孕階段及孕早、中、晚期推薦個(gè)體化的因地制宜的健康飲食指導(dǎo)意見。