周翠萍 張 力 江志雄

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧市 530001，電子郵箱：873072260@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)面修復(fù)、周圍血管科， 南寧市 530012)

近年來，糖尿病已成為困擾全球的健康問題，其患者數(shù)量呈上升趨勢，雖不直接危害生命，但它嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，已被納入中國慢性疾病譜，且在老年病中排名前十[1-2]。糖尿病潰瘍是其嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，由于糖尿病潰瘍所致截肢的患者人數(shù)一直居高不下，已成為近年來學(xué)者研究的熱點。廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床上應(yīng)用壯藥拔毒生肌膏治療糖尿病潰瘍、壓瘡、缺血性潰瘍等慢性難愈合創(chuàng)面取得良好效果，但其作用機制有待進一步研究。前期研究表明，壯藥拔毒生肌膏能夠促進大鼠氧化應(yīng)激性創(chuàng)面愈合，并上調(diào)其表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及溶菌酶的表達[3]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)聯(lián)合背部打孔法建立糖尿病大鼠創(chuàng)面模型，24 h后用藥干預(yù)，光鏡下觀察創(chuàng)面組織病理情況并計算大鼠創(chuàng)面愈合率，同時檢測血清和組織中EGF、VEGF及血清溶菌酶水平變化情況，進一步研究壯藥拔毒生肌膏促進糖尿病創(chuàng)面愈合的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 壯藥拔毒生肌膏由宮粉、輕粉、硼砂、白芷、大黃、槐枝、白蠟、豬脂等按一定比例配制，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科制備；重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠(貝復(fù)濟，珠海億勝生物制藥，批號：S20040001)。

1.2 實驗動物 健康雄性SD大鼠96只，無特定病原體級，體重(225±15)g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(湘)2014-0011。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗，所有實驗動物均取得廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理審查委員會審批。

1.3 實驗試劑及儀器 STZ(Sigma公司，貨號：S0130)，檸檬酸鈉緩沖液溶解，避光，冰浴，反復(fù)吹打至完全溶解為淡黃色澄清液體，現(xiàn)配現(xiàn)用；EGF、VEGF放射免疫試劑盒(北京華英生物，批號均為20180421)，溶菌酶測試盒(南京建成生物工程所，批號：AO50-1)，大鼠 EGF 酶聯(lián)免疫試劑盒(聯(lián)科生物工程研究所，批號：EK3831/2)，VEGF抗體試劑盒(武漢博士德，批號：BA0407)。低速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號：TDL-80-2B)，輪轉(zhuǎn)式切片機(徠卡公司，型號：RM2235)，倒置顯微鏡和成像系統(tǒng)(日本尼康公司，型號：Nikon Ci-S、Nikon DS-U3)，脫水機和包埋機(武漢俊杰電子有限公司，型號：JT-12S、JB-P7)，全自動放免計數(shù)儀(西安核儀器廠，型號：XH-6020)，酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司，型號：Multiskan TC)，恒溫震蕩培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司，型號：ST70-2)，烤片機(常州國華電器有限公司，型號：DB-B2)。

1.4 分組及糖尿病大鼠模型的建立 按隨機數(shù)字法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、貝復(fù)濟組、拔毒生肌膏組，各24只。除假手術(shù)組外其余各組均腹腔注射STZ制作糖尿病大鼠模型[4]：誘導(dǎo)前禁食24 h，誘導(dǎo)時給予65 mg/kg STZ溶液腹腔注射，在30 min內(nèi)完成注射，注射結(jié)束后更換墊料，1 h后喂食飼料。各組大鼠于注射前稱體重并測定血糖，注射后72 h每日測定體重、血糖，持續(xù)2周。注射前隨機血糖水平<8.9 mmol/L，注射后72 h隨機血糖水平≥16.7 mmol/L，即視為糖尿病模型誘導(dǎo)成功，若血糖不達標(biāo)者，3 d后補注射20 mg/kg STZ溶液，再監(jiān)測血糖情況。

1.5 糖尿病大鼠創(chuàng)面模型的建立及干預(yù) 糖尿病大鼠模型制備成功1周后，制備大鼠創(chuàng)面模型[3]。先用標(biāo)記筆在大鼠背部畫出直徑約為1.8 cm的圓形創(chuàng)面，腹腔注射10%水合氯醛溶液(1.2 mL/L)，麻醉成功后采用組織剪沿標(biāo)記筆筆記剪開皮膚組織，深至皮下，立即采用呋喃西林液清潔創(chuàng)面。根據(jù)創(chuàng)面大小將紗條剪成超出創(chuàng)面約0.5 cm小方塊紗條，24 h后拔毒生肌膏組創(chuàng)面外敷拔毒生肌膏紗條，貝復(fù)濟組創(chuàng)面外敷貝復(fù)濟浸透紗條，假手術(shù)組和模型組創(chuàng)面外敷生理鹽水紗條，最后各組均覆蓋兩層無菌干紗布，膠布固定，1次/d。持續(xù)干預(yù)12 d。

1.6 標(biāo)本采集 藥物干預(yù)后 3 d、6 d 及12 d各組按隨機數(shù)字表法，分別取8只大鼠，10%水合氯醛溶液(大鼠30 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹腔動脈采血2 mL，靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min，移液槍吸取上清液2 mL，放置-80℃冰箱待測。取血后采集相同位點創(chuàng)面組織，分成兩份，一份創(chuàng)面組織用4%多聚甲醛常溫固定，另一份組織置于凍存管，放置液氮中凍存待測。

1.7 檢測指標(biāo)

1.7.1 創(chuàng)面愈合率：用標(biāo)記筆在透明方格紙畫出各組大鼠創(chuàng)傷后24 h、3 d、6 d及12 d創(chuàng)面，以傷后24 h第一次畫的創(chuàng)面面積為創(chuàng)傷面積，以各時相點取材時的創(chuàng)面面積為時相點創(chuàng)面面積。采用ImageJ軟件計算創(chuàng)面面積。創(chuàng)面愈合率=[(創(chuàng)傷面積-時相點創(chuàng)面面積)/創(chuàng)傷面積]×100%[5]。

1.7.2 血清EGF、VEGF和溶菌酶的檢測：參照EGF、VEGF放射免疫試劑盒說明書，檢測血清EGF、VEGF的含量；根據(jù)溶菌酶試劑盒檢測步驟，采用比濁法檢測血清溶菌酶含量。

1.7.3 組織EGF和VEGF的檢測：參照各試劑盒說明書，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定組織EGF表達；采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶檢測組織VEGF表達。VEGF結(jié)果的判讀：低倍鏡下尋找陽性表達較集中的地方(在血管內(nèi)皮細胞胞漿中呈現(xiàn)棕黃色)，在400倍光鏡下隨機拍照3個視野，各計數(shù)100個細胞，結(jié)果采用半定量分析。首先對陽性強度進行評分，無表達為0分；弱陽性為血管內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)顆粒較細，顯色高于背景，評為1分；陽性為血管內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)顆粒細而多，顯色較明顯，評為2分；強陽性為胞漿內(nèi)陽性顆粒粗而多，顯色明顯，評為3分。然后把弱陽性的細胞數(shù)乘1分，陽性細胞數(shù)乘2分，強陽性細胞數(shù)乘3分，計算平均每張切片陽性細胞VEGF表達的累計積分[6]。

1.7.4 創(chuàng)面組織的病理觀察：選擇合適部位取材組織厚度約3 mm，常規(guī)組織脫水、浸蠟，石蠟包埋，切片，烤片，脫蠟，高濃度梯度酒精脫蠟，蘇木精復(fù)染，鹽酸分化，氨水返藍，伊紅染色，低濃度酒精沖洗，吹干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織生長情況(光學(xué)顯微鏡400倍)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，方差齊則組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊則采用秩和檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率 模型組干預(yù)后3 d及12 d的創(chuàng)面愈合率均低于假手術(shù)組(均P<0.05)。與模型組比較，貝復(fù)濟組干預(yù)后3 d及6 d的創(chuàng)面愈合率均升高，拔毒生肌膏組干預(yù)后6 d及12 d的創(chuàng)面愈合率均升高(均P<0.05)；且拔毒生肌膏組各時間點的創(chuàng)面愈合率與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而貝復(fù)濟組干預(yù)后 12 d的創(chuàng)面愈合率低于假手術(shù)組和拔毒生肌膏組(均P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點4組大鼠創(chuàng)面愈合率比較(x±s,%)

2.2 各組大鼠血清EGF和VEGF水平比較 (1)血清EGF水平：與假手術(shù)組比較，模型組干預(yù)后3 d的EGF水平降低(P<0.05)，貝復(fù)濟組和拔毒生肌膏干預(yù)后6 d及12 d EGF水平均升高(均P<0.05)，而其余時間點3組血清EGF水平與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；貝復(fù)濟組和拔毒生肌膏組各時間點血清EGF水平均高于模型組；拔毒生肌膏組干預(yù)后6 d的血清EGF水平低于貝復(fù)濟組(P<0.05)，而其余時間點兩組血清EGF水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。(2)血清VEGF水平：與假手術(shù)組比較，模型組干預(yù)后3 d、6 d的VEGF水平降低，貝復(fù)濟組干預(yù)后12 d的VEGF水平升高，拔毒生肌膏組干預(yù)后6 d VEGF水平降低(均P<0.05)，而其余時間點3組血清VEGF水平與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；貝復(fù)濟組各時間點的血清VEGF水平均高于模型組，而拔毒生肌膏組干預(yù)后6 d、12 d的血清VEGF水平均高于模型組(P<0.05)；各時間點，貝復(fù)濟組與拔毒生肌膏組的血清VEGF水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 不同時間點4組大鼠血清EGF、VEGF水平比較(x±s，ng/mL)

2.3 各組大鼠組織EGF、VEGF水平比較 (1)組織EGF水平：與假手術(shù)組比較，模型組干預(yù)后3 d的組織EGF水平升高，而干預(yù)后6 d及12 d組織EGF水平降低，貝復(fù)濟組、拔毒生肌膏組干預(yù)后3 d的組織EGF水平降低，而干預(yù)后12 d的組織EGF水平升高(均P<0.05)，其余時間點3組組織EGF水平與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；與模型組比較，貝復(fù)濟組、拔毒生肌膏組干預(yù)后3 d組織EGF水平降低，而其余時間點水平升高(均P<0.05)；各個時間點，貝復(fù)濟組與拔毒生肌膏組的組織EGF水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。(2) 組織VEGF水平:與假手術(shù)組比較，模型組干預(yù)后3 d及6 d組織VEGF水平降低，拔毒生肌膏組干預(yù)后3 d組織VEGF水平降低(均P<0.05)，其余時間點3組組織VEGF水平與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；各個時間點，貝復(fù)濟組與拔毒生肌膏組的組織VEGF水平均高于模型組(均P<0.05)，但兩組間組織VEGF水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 不同時間點4組大鼠組織EGF、VEGF水平比較(x±s，ng/mL)

2.4 各組大鼠血清溶菌酶水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組干預(yù)后3 d、12 d血清溶菌酶水平降低，拔毒生肌膏組、貝復(fù)濟組干預(yù)后3 d的血清溶菌酶水平降低，而干預(yù)后6 d血清溶菌酶水平升高(均P<0.05)，其余時間點3組血清溶菌酶水平與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；各個時間點，貝復(fù)濟組與拔毒生肌膏組血清的溶菌酶水平均高于模型組(均P<0.05)，但兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表4。

表4 不同時間點4組大鼠血清溶菌酶水平比較(x±s，ng/mL)

2.5 各組大鼠創(chuàng)面組織病理變化 假手術(shù)組干預(yù)后3 d創(chuàng)面組織輕度水腫,痂下肉芽組織開始生成；干預(yù)后6 d創(chuàng)面組織水腫逐漸減輕，創(chuàng)面可見大量新生毛細血管,大量成纖維細胞整齊排列于創(chuàng)面；干預(yù)后12 d創(chuàng)面組織大部分已被鱗狀上皮覆蓋，痂下肉芽組織已成熟。模型組干預(yù)后3 d、6 d創(chuàng)面組織明顯水腫和出血,并化膿結(jié)痂，創(chuàng)面炎性反應(yīng)較重，直到干預(yù)后12 d創(chuàng)面組織水腫和出血逐漸消失，但仍有白細胞滲出和淋巴細胞浸潤。貝復(fù)濟組干預(yù)后3 d創(chuàng)面炎性反應(yīng)、組織水腫和出血明顯，痂下肉芽組織生長快于模型組；干預(yù)后6 d創(chuàng)面組織水腫和出血現(xiàn)象開始消失，成纖維細胞增多，新生毛細血管變多；干預(yù)后12 d創(chuàng)面組織一半已被鱗狀上皮覆蓋，痂下肉芽組織開始成熟。拔毒生肌膏組大鼠早期組織病理變化與貝復(fù)濟組相似，干預(yù)后3 d、6 d痂下肉芽組織生長較快，干預(yù)后6 d創(chuàng)面組織水腫和出血消失，成纖維細胞、新生毛細血管均增加；干預(yù)后12 d痂下可見逐漸成熟的肉芽組織，鱗狀上皮已覆蓋一半的創(chuàng)面組織。見圖1。

圖1 各組大鼠不同時相創(chuàng)面組織形態(tài)變化

3 討 論

糖尿病足潰瘍是糖尿病最嚴(yán)重且影響較大的并發(fā)癥之一[7]。有研究顯示，近3年來全球約有4.51億人罹患糖尿病,其中糖尿病足潰瘍患者約占15%[8]。糖尿病足潰瘍截肢率不斷上升，給患者自身的身心健康、生活、工作及家庭均帶來極大的影響[9]。隨著時代的發(fā)展進步，大多數(shù)人越來越追求肢體及軀體的完美性，而中醫(yī)藥外敷在糖尿病足潰瘍治療中具有簡、便、廉、驗的優(yōu)勢[10]，有研究表明生肌玉紅膏、濕潤燒傷膏應(yīng)用于糖尿病潰瘍效果顯著[3,11-12]，這讓多數(shù)患者克服了長期內(nèi)服用藥及肢體缺失的恐懼感，為中藥外敷辨證治療慢性難愈性創(chuàng)面奠定了一定的基礎(chǔ)。壯藥拔毒生肌膏具有拔毒生肌、去瘀生新的功效，通過液化壞死組織，促進上皮爬行及新生肉芽組織生長[13]，給糖尿病足潰瘍等慢性難愈性創(chuàng)面患者帶來福音。

本研究結(jié)果顯示假手術(shù)組創(chuàng)面(非高糖狀態(tài))愈合快速，而模型組干預(yù)后3 d及12 d的創(chuàng)面愈合率均低于假手術(shù)組，表明大鼠在高糖狀態(tài)下創(chuàng)面愈合緩慢，提示糖尿病是抑制創(chuàng)面愈合的重要因素。貝復(fù)濟在臨床上常用于治療壓瘡、燒傷等創(chuàng)面，能加快上皮細胞爬行，促進創(chuàng)面愈合效果顯著[14-15]，故本研究將其作為對照組藥物。本研究中拔毒生肌膏組、貝復(fù)濟組的糖尿病模型大鼠創(chuàng)面組織水腫和出血較早消失，肉芽組織較快生長，在干預(yù)后12 d兩組大鼠創(chuàng)面痂下肉芽組織已開始成熟，創(chuàng)面組織超過半數(shù)被鱗狀上皮覆蓋，而模型組創(chuàng)面組織仍有白細胞滲出和淋巴細胞浸潤，創(chuàng)面水腫和出血慢慢消失；同時，與模型組比較，貝復(fù)濟組干預(yù)后3 d及6 d的創(chuàng)面愈合率均升高，拔毒生肌膏組干預(yù)后6 d及12 d的創(chuàng)面愈合率均升高(均P<0.05)。這提示拔毒生肌膏和貝復(fù)濟能夠加速糖尿病合并創(chuàng)面愈合，均是治療糖尿病合并創(chuàng)面愈合的有效藥物。但拔毒生肌膏組各時間點的創(chuàng)面率與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而貝復(fù)濟組干預(yù)后12 d的創(chuàng)面愈合率低于假手術(shù)組和拔毒生肌膏組(均P<0.05)，即拔毒生肌膏在后期促進創(chuàng)面愈合速度加快，提示拔毒生肌膏的作用優(yōu)于貝復(fù)濟。

創(chuàng)面修復(fù)由止血期、炎癥反應(yīng)期、增殖性修復(fù)期和傷口重塑4個過程組成。愈合過程中EGF是促進創(chuàng)面愈合的生長因子[15]，其主要在創(chuàng)面愈合中后期促進創(chuàng)面再上皮化，同時在炎癥階段也能促進各種細胞的增殖遷移[16]；此外，VEGF亦是較為重要的促進創(chuàng)面愈合的生長因子[18-21]，其只作用于血管內(nèi)皮細胞，促進血管生成。溶菌酶具有殺菌抗炎作用，能夠促進組織修復(fù)及提高免疫力[22]，其表達上調(diào)有利于創(chuàng)面愈合[23]。有研究顯示，給予溶菌酶-抗菌肽融合蛋白作用于糖尿病創(chuàng)面，利于創(chuàng)面修復(fù)及肉芽組織中的血管生成，降低促炎因子的水平[24]。本研究中，干預(yù)后6 d、12 d貝復(fù)濟組、拔毒生肌膏組血清及組織EGF、VEGF水平均高于模型組；各個時間點貝復(fù)濟組與拔毒生肌膏組的血清溶菌酶水平均高于模型組(均P<0.05)。這提示貝復(fù)濟及拔毒生肌膏均能上調(diào)糖尿病大鼠血清及創(chuàng)面組織EGF、VEGF的表達，以及血清溶菌酶水平，從而加快創(chuàng)面愈合。

本研究中，拔毒生肌膏在創(chuàng)面愈合后期的作用優(yōu)于貝復(fù)濟，然而除干預(yù)后6 d拔毒生肌膏組的血清EGF水平低于貝復(fù)濟組外，貝復(fù)濟組、拔毒生肌膏組其余時間點血清EGF水平，以及各個時間點組織EGF和VEGF、血清溶菌酶水平均無明顯差異(P>0.05)，這表明貝復(fù)濟、拔毒生肌膏促進EGF、VEGF表達的能力相當(dāng)。貝復(fù)濟本質(zhì)是成纖維細胞因子，作用靶點明確；而拔毒生肌膏的分子作用機制不明，其可能通過多靶點，多信號通路調(diào)控創(chuàng)面愈合，其作用機制有待進一步探索及研究。

綜上所述，壯藥拔毒生肌膏通過調(diào)控血清和組織EGF、VEGF及血清溶菌酶表達，改善糖尿病大鼠創(chuàng)面肉芽水腫，加快創(chuàng)面組織上皮爬行，進而促進創(chuàng)面愈合，且其在后期促進創(chuàng)面愈合的作用優(yōu)于貝復(fù)濟，這為臨床中藥外用于糖尿病創(chuàng)面提供有用的實驗數(shù)據(jù)。目前，對于壯藥拔毒生肌膏分子生物學(xué)的研究仍較少，僅局限于臨床觀察，其促進創(chuàng)面愈合的相關(guān)通路及多靶點的研究有待進一步明確。