王鑫蕾 張榮萍 趙小芹 顧云娟

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，江蘇省南通市 226001，電子郵箱：411077007@qq.com)

糖尿病腎病是糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一。隨著我國糖尿病發(fā)病率的逐年升高，糖尿病腎病的發(fā)病率也呈上升趨勢，成為終末期腎病的第二大致病因素[1]。糖尿病腎病的發(fā)病涉及多種因素，如糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、血流動力學(xué)異常、炎癥因子及遺傳易感因素等，其中糖脂代謝紊亂與炎癥因子起到至關(guān)重要的作用[2]。車前草為車前科植物，又名車前、錢串草、車輪菜、豬耳菜等，具有清熱利尿、抗炎、調(diào)節(jié)血糖血脂、降血尿酸、抗衰老、護(hù)肝等藥理作用[3]。本研究觀察車前草提取物對糖尿病腎病模型大鼠腎功能、糖脂代謝、炎癥因子及脂肪因子的影響，以探討車前草提取物對糖尿病腎病的治療作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性8～10周齡SD大鼠60只，購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SYXK(蘇)2017-0046]，在無特定病原體級環(huán)境中飼養(yǎng)，12 h明暗交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及儀器 實(shí)驗(yàn)藥物包括車前草干燥全草(南通大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，批號：1709001)，纈沙坦(北京諾華制藥有限公司，批號：X2684)，鏈脲佐菌素(Sigma公司，批號：S0130)。實(shí)驗(yàn)試劑包括尿蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20170829)，白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA試劑盒(美國R&D公司，批號：10184-1-AP)，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)ELISA試劑盒(美國R&D公司，批號：18978-1-AP)，脂聯(lián)素ELISA試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號：QY-s2089)，游離脂肪酸結(jié)合蛋白4(free fatty acid-binding protein 4,FABP4) ELISA試劑盒(上海一研生物科技有限公司公司，批號：EY-3533)；肌酐、尿素氮、總膽固醇、三酰甘油試劑盒均購自南京建成生物研究所(批號：C011-2-1、C013-2-1、A111-2-1、A110-2-1)。實(shí)驗(yàn)儀器包括血糖試紙(Bayer公司，批號：DP9DM3F10A)，血糖儀(Bayer公司，批號：SN9531964 )，LED-A2000天平(福建華志公司)，Allegra?X-15R Centrifuge型離心機(jī)(Beckman Coulter公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及建模：將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、對照組、低劑量組、中劑量組與高劑量組，每組10只。除正常組外，其余大鼠均使用高糖高脂飼料喂養(yǎng)兩周后，一次性腹腔注射32%鏈脲佐菌素(按照45 mg/kg)建立糖尿病腎病大鼠模型，血糖≥16.7 mmol/L、24 h尿蛋白含量>30 mg，提示建模成功。

1.3.2 車前草提取物制備：取車前草干燥全草100 g，加入8倍藥材質(zhì)量的65%乙醇，加熱回流2 h，共3次。將3次回流濾液濃縮至100 mL，生藥含量1 g/mL，冷藏備用，車前草提取物的給藥劑量根據(jù)生藥量計算。

1.3.3 給藥方式：建模成功3 d后，對照組大鼠給予40 mg/kg纈沙坦灌胃，低劑量組、中劑量組與高劑量組分別給予1.17 g/kg、2.34 g/kg、4.68 g/kg車前草提取物灌胃，模型組大鼠給予與車前草實(shí)驗(yàn)組等體積的0.9%氯化鈉灌胃，均1次/d，持續(xù)兩周。正常組大鼠不做任何干預(yù)。

1.4 觀察指標(biāo) (1)干預(yù)兩周后，收集6組大鼠24 h尿液，采用考巴斯亮藍(lán)法測定24 h尿蛋白含量。(2)大鼠禁食12 h后，記錄大鼠體重，尾靜脈斷尾采血0.5～1.0 mL，采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖水平，然后在4℃條件下，6 000 r/min離心5 min分離血清，使用ELISA法檢測脂聯(lián)素及FABP4水平；眼內(nèi)眥取靜脈血0.3～1.0 mL，在4℃條件下，6 000 r/min離心5 min分離血清后采用ELISA法檢測血清IL-6水平，肌氨酸氧化酶法檢測肌酐，脲酶法檢測尿素氮，單試劑磷酸甘油氧化酶-過氧化物酶法檢測總膽固醇及三酰甘油。(3)二氧化碳窒息處死大鼠后，剝離腎臟周圍脂肪組織后迅速摘除雙腎，計算腎指數(shù)=雙腎重量(mg)/處死前總體重(g)。(4)取20 μg右腎組織，磷酸緩沖鹽溶液沖洗后，將腎臟組織剪碎，以1 ∶9的比例加入預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液，于冰上勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管，在4℃條件下，2 000 r/min離心10 min，以ELISA法檢測腎臟組織TGF-β水平。所有檢測均嚴(yán)格按照試劑盒說明書完成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 6組大鼠腎指數(shù)的比較 6組大鼠腎指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中模型組、對照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組腎指數(shù)均高于正常組；對照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組的腎指數(shù)均低于模型組；低劑量組、中劑量組的腎指數(shù)均高于對照組(均P<0.05)，而高劑量組與對照組比較無明顯差異(P>0.05)；低、中、高劑量組的腎指數(shù)依次下降(均P<0.05)。見表1。

表1 6組大鼠腎指數(shù)的比較(x±s)

2.2 6組大鼠血糖、腎功能及血脂水平比較 其余5組的血糖、肌酐、尿素氮、總膽固醇及三酰甘油水平均高于正常組(均P<0.05)；與模型組比較，對照組及各劑量組的肌酐、尿素氮及三酰甘油均降低，各劑量組血糖均降低，對照組及中、高劑量組總膽固醇水平降低(均P<0.05)；與對照組比較，中、高劑量組的血糖、肌酐及尿素氮水平均降低，各劑量組的三酰甘油水平均降低，但低、中劑量組的總膽固醇水平升高(均P<0.05)；低、中、高劑量組的血糖、肌酐、尿素氮、總膽固醇水平均依次降低，且中、高劑量組的三酰甘油水平低于低劑量組(均P<0.05)。見表2。

表2 6組大鼠血糖、腎功能及血脂水平比較(x±s)

2.3 6組大鼠24 h尿蛋白、血清IL-6、脂聯(lián)素、FABP4及腎臟組織TGF-β水平比較 與正常組比較，其余5組的24 h尿蛋白、腎臟組織TGF-β以及血清脂聯(lián)素、FABP4均升高，且模型組的血清IL-6升高而4個干預(yù)組血清IL-6下降(均P<0.05)；與模型組比較，各干預(yù)組的24 h尿蛋白、血清IL-6、脂聯(lián)素均下降，且對照組及中、高劑量組的血清FABP4、腎臟組織TGF-β均降低(均P<0.05)；與對照組比較，各劑量組的24 h尿蛋白均升高且血清IL-6降低，高劑量組血清FABP4均降低，但低、中劑量組的血清脂聯(lián)素、腎臟組織TGF-β以及低劑量組的血清FABP4均升高(均P<0.05)；低、中、高劑量組的24 h尿蛋白、血清脂聯(lián)素、IL-6、FABP4以及腎臟組織TGF-β均依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 6組大鼠24 h尿蛋白、血清IL-6、脂聯(lián)素、FABP4及腎臟組織TGF-β水平比較(x±s)

3 討 論

糖尿病腎病目前已成為終末期腎病重要病因[4]，臨床特征主要包括腎小球?yàn)V過率下降及尿蛋白量增加。糖尿病腎病的病理變化為：初始階段腎小球高灌注及高濾過，致腎小球?yàn)V過率增加，腎小球毛細(xì)血管尿白蛋白漏出，從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變，如腎小球基底膜增厚、腎小球肥大、腎小球硬化、系膜細(xì)胞擴(kuò)張、足細(xì)胞損傷及丟失[5]。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣：在糖脂代謝紊亂前提下，機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激被激活，促炎癥介質(zhì)如IL-6等釋放，與膜結(jié)合IL-6受體及gp130信號轉(zhuǎn)換鏈結(jié)合，從而促進(jìn)腎小管間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖與分化，導(dǎo)致腎小球內(nèi)浸潤單核巨噬細(xì)胞，引起細(xì)胞外基質(zhì)增多，促進(jìn)腎小球及腎小管硬化[6]。而TGF-β為多效性細(xì)胞因子，作為腎臟纖維化的重要介質(zhì)，促進(jìn)下游信號通路的激活，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，從而引起腎間質(zhì)纖維化致腎小球硬化[7]。本研究結(jié)果顯示，車前草提取物各劑量組糖尿病腎病大鼠的腎臟指數(shù)、血糖、腎功能指標(biāo)、24 h尿蛋白、三酰甘油、IL-6均低于模型組(均P<0.05)，且中、高劑量組腎臟組織TGF-β、總膽固醇均低于模型組(均P<0.05)，提示車前草提取物可以降低糖尿病腎病大鼠模型IL-6及TGF-β水平，改善腎功能及糖脂代謝從而預(yù)防腎小球及腎小管硬化。以上指標(biāo)(除三酰甘油外)均隨藥物劑量的增加而降低，提示高劑量的車前草提取物干預(yù)效果更好。

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的內(nèi)源性活性因子，由胰島素刺激而分泌，具有抗胰島素抵抗、抗動脈粥樣硬化、抗炎反應(yīng)、調(diào)節(jié)糖脂代謝等作用，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)游離脂肪酸氧化、提高外周組織胰島素敏感性、抑制葡萄糖再生[8]。脂聯(lián)素與胰島素抵抗具有相關(guān)性，而胰島素抵抗通過多種途徑損傷腎臟組織，因此隨著糖尿病腎病不斷發(fā)展，脂聯(lián)素水平與糖尿病腎臟功能受損程度呈正相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病大鼠模型組的脂聯(lián)素水平高于正常組(P<0.05)，且對照組、各劑量組的脂聯(lián)素水平均低于模型組，而低劑量組、中劑量組的脂聯(lián)素水平均高于對照組(均P<0.05)，而高劑量組脂聯(lián)素水平與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，提示車前草提取物能降低糖尿病腎病大鼠血清脂聯(lián)素水平，從而改善腎臟功能受損程度，尤其是高劑量的效果最佳。

FABP4由脂肪細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌，主要參與游離脂肪酸儲存、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化；高FABP4水平與超重及肥胖、糖脂代謝紊亂、動脈粥樣硬化相關(guān)，是代謝綜合征的早期危險因子[10]。此外，F(xiàn)ABP4在非糖尿病及2型糖尿病終末期腎臟損傷患者體內(nèi)均升高[11]，且其是2型糖尿病早期糖尿病腎病的生物學(xué)標(biāo)志[12]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病大鼠模型組的血清FABP4水平高于正常組(P<0.05)，且對照組、中劑量組及高劑量組的FABP4水平均低于模型組，而低劑量組FABP4水平高于對照組，高劑量組FABP4水平低于對照組(均P<0.05)，提示車前草提取物能降低糖尿病腎病大鼠血清FABP4水平，從而對糖尿病腎病大鼠腎臟損傷起到保護(hù)作用，高劑量車前草提取物作用最為顯著。

此外，既往研究表明，車前草可分離出黃酮及其苷類、多酚類、多糖類、三萜及甾體類、苯甲基咖啡酰糖脂類等多種化合物[13]，其中黃酮及其苷類、多酚類具有抗氧化酶活性，能有效地清除2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，抑制脂質(zhì)體過氧化進(jìn)程，提高體內(nèi)抗氧化酶活性，減輕細(xì)胞內(nèi)部自由基損傷，從而達(dá)到抗氧化作用[14]。同時，車前草多糖可通過增加白細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群及淋巴細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬，而提高機(jī)體免疫活性[15]。因此，車前草可能通過抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫活性的途徑治療糖尿病腎病。

綜上所述，車前草提取物可改善糖尿病腎病大鼠糖脂代謝及腎功能，下調(diào)炎癥因子、脂肪因子的表達(dá)，其中高劑量(4.68 g/kg)車前草提取物的干預(yù)效果更佳。但本研究仍存在不足，如樣本量較少、觀察時間較短、觀察指標(biāo)較少等，在后續(xù)研究中將進(jìn)一步探討車前草提取物對糖尿病腎病的影響及機(jī)制。