李 敏 董 虹 陳湘漪

(湖北省婦幼保健院婦科,武漢市 430070，電子郵箱： 423611361@qq.com)

復發(fā)性流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指在妊娠第24周之前重復發(fā)生2次或2次以上的流產，其在孕齡婦女中的發(fā)病率約為5%[1]。RSA的發(fā)病機制十分復雜，遺傳因素、子宮結構異常、內分泌和免疫功能紊亂等都是RSA的危險因素[2]。其中遺傳因素的作用最為重要，有學者報告遺傳因素能解釋50%以上的RSA[3]。

雌激素是生殖過程中最為關鍵的類固醇激素之一，其作用主要由雌激素受體(estrogen receptor，ESR)介導。ESR分為ESRα和ESRβ兩種，分別由同名基因ESRα和ESRβ編碼[4]。其中，ESRβ基因位于染色體14q22-24，包含8個外顯子，其在受精卵著床和胚胎發(fā)育過程中十分重要。自從Aléssio等[5]率先報告了ESRβ基因多態(tài)性與RSA之間的關聯(lián)性，其他研究人員也開展了類似研究，但是得到的結果并不一致。本文將采用薈萃分析的方法，對已發(fā)表的研究結果進行合并，以期得到更加可靠的結果。

1 資料與方法

1.1 檢索策略 計算機檢索PubMed、Web of Science、Embase、Cochrane Library、中國知網和萬方6個電子數據庫。檢索策略為主題詞+自由詞。PubMed數據庫的檢索式為：(“Polymorphism,Single Nucleotide”[Mesh] OR Single nucleotide polymorphism OR Variant OR SNP OR Polymorphism OR Variation OR Mutant OR Mutation)AND(Estrogen Receptor beta OR“Estrogen Receptor beta”[Mesh] OR Receptors,Estrogen,Type Ⅱ OR Estrogen Receptor Type Ⅱ OR Estrogen Nuclear Receptor OR “Receptors,Estrogen”[Mesh] OR Estrogen Receptor)AND(Abortions,Spontaneous OR Spontaneous Abortion OR Early Pregnancy Losses OR Loss,Early Pregnancy OR Pregnancy Loss,Early OR Miscarriage OR Tubal Abortion OR Habitual Abortion OR Recurrent Abortion OR Recurrent Miscarriage OR “Abortion,Spontaneous”[Mesh])。將以上檢索式按Web of Science、Embase和Cochrane Library的檢索要求變換格式后進行檢索。中文數據庫的檢索式為：“流產”AND“雌激素受體”AND“多態(tài)性”。語種不限，檢索時間為建庫至2019年5月10日。此步驟由本文前兩位作者分別獨立完成。

1.2 納入和排除標準 納入標準：(1)病例-對照研究或隊列研究；(2)病例組研究對象符合RSA的診斷標準，即在妊娠第24周之前重復發(fā)生2次或2次以上的不明原因的自發(fā)性流產[1]；(3)涉及ESRβ基因多態(tài)性；(4)病例組和對照組的研究對象不少于50例；(5)能夠獲得文獻全文，并且提供病例組和對照組的基因型頻率，能夠計算比值比(odds ratio，OR)和95%CI；(6)納入的文獻必須是同行評審的學術論文。排除標準：(1)重復發(fā)表的文獻；(2)動物研究；(3)會議摘要；(4)綜述及病例系列報道。

1.3 文獻篩選和信息提取 按照預先制定的納入和排除標準，本文前兩位作者分別獨立完成文獻的篩選。確定文獻符合入選標準后，提取以下信息：第一作者的姓名、發(fā)表年份、開展研究的國家、種族、流產次數、樣本量及病例組和對照組的基因型頻率。此過程中如果遇到分歧，共同商討解決。

1.4 方法學質量評價 本文前兩位作者分別利用紐卡斯爾-渥太華量表(Newcastle-Ottawa Scale，NOS)[6]對納入文獻的質量進行評估。NOS采用星級評價標準，由研究對象的選擇、病例組和對照組的可比性、暴露因素的測量3個方面構成，包括8個條目，共9顆星。當納入文獻獲得≥5顆星時，可視為高質量文獻。計算納入研究的對照組人群基因頻率是否符合哈迪-溫伯格遺傳平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)[7]；當P>0.05時表明對照組基因頻率分布符合HWE，選擇人群代表性良好；反之則不符合HWE，選擇人群代表性欠佳。在質量評估過程中如有分歧，通過商討解決。

1.5 統(tǒng)計學分析 利用RevMan 5.3軟件進行統(tǒng)計學分析。分別計算出等位基因模型(M/m)、純合子模型(MM/mm)、雜合子模型(MM/Mm)、顯性模型(MM+Mm/mm)及隱性模型(MM vs.Mm/mm)的OR值及其95%CI，其中M為頻率較大的等位基因，m為頻率較小的等位基因。用I2檢驗來評估納入研究之間的異質性：當P≥0.10或I2<50%時，表明異質性較小，采用固定效應模型進行分析；當P<0.10或I2≥50%時，表明異質性較大，采用隨機效應模型進行分析。為了探索ESRβ基因多態(tài)性和RSA的發(fā)生是否存在種族特異性，根據種族進行亞組分析。Meta分析結果以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。通過逐一排除單項研究的方式來檢測研究結果的敏感性。當納入研究的數量不少于10篇時，利用漏斗圖法來評估研究的發(fā)表偏倚。

2 結 果

2.1 文獻檢索結果 通過初步檢索共獲得155篇相關文獻，去除50篇重復文獻后剩下105篇；通過閱讀題目和摘要，剔除了86篇明顯不相關的文獻；閱讀剩余的19篇文獻全文后，發(fā)現(xiàn)有13篇不符合納入標準，將其排除。最終獲得了6篇文獻[5,8-12]。

2.2 納入文獻的基本特征和NOS評估結果 納入的6篇文獻包括5篇英文文獻[5,9-12]和1篇中文文獻[8]。3項研究[5,9,12]對RSA的定義是自發(fā)流產次數不少于3次，另外3項研究[8,10- 11]對RSA的定義是自發(fā)流產次數不少于2次。除了Aléssio等[5]的研究包括高加索人和非洲人，其余研究均在單一種族中開展。6項研究共納入了1 125例RSA患者和870例健康對照個體，每項研究的病例組和對照組的樣本量均超過50個。納入的研究共涉及rs1256049、rs4986938和rs1256030這3個多態(tài)性位點，其中涉及rs1256049多態(tài)性的6項研究[5,8-12]均符合HWE，涉及rs4986938多態(tài)性的5項研究[5,8-11]中有3項[8-10]不符合HWE，涉及rs1256030多態(tài)性的2項研究[8-9]均符合HWE。納入文獻的基本特征見表1。根據NOS評價標準，納入的每項研究至少得到了5顆星，均為高質量研究，見表2。

表1 納入文獻基本特征

表2 紐卡斯爾-渥太華量表的評估結果

2.3 薈萃分析和亞組分析結果

2.3.1 ESRβ基因rs1256049位點多態(tài)性與RSA易感性的關系：6項研究[5,8-12]報告了rs1256049位點多態(tài)性與RSA的關系。在5種遺傳模型下，各研究之間無明顯的異質性，因此均采用固定效應模型進行分析。結果顯示，在5種遺傳模型下rs1256049位點多態(tài)性與RSA易感性均無關(均P>0.05)。 見表3。

亞組分析中，除在高加索和非洲人群中，等位基因模型下各研究間存在異質性，采用隨機效應模型進行分析外，其他均采用固定效應模型進行分析。結果顯示，在亞洲人群中，隱性模型下rs1256049位點多態(tài)性和RSA有關(P<0.05)，GG攜帶者患RSA的風險較低；而其他遺傳模型下，rs1256049位點多態(tài)性與RSA易感性無關(P>0.05)。在高加索和非洲人群中，5種遺傳模型下rs1256049位點多態(tài)性與RSA易感性均無關(均P>0.05)。見表3。

表3 ESRβ基因rs1256049位點多態(tài)性與RSA易感性關系的Meta分析結果

2.3.2 ESRβ基因rs4986938位點多態(tài)性與RSA易感性的關系：5項研究[5,8-11]報道了rs4986938位點多態(tài)性與RSA的關系。在5種遺傳模型下，各研究間均無顯著的異質性，故采用固定效應模型進行分析。結果顯示在純合子模型、雜合子模型和顯性模型下，rs4986938位點多態(tài)性與RSA易感性有關(均P<0.05)，GG和GA攜帶者患RSA的風險較高，但是在等位基因模型和隱性模型下，rs4986938位點多態(tài)性與RSA易感性無相關性(均P>0.05)。見表4。

亞組分析中，在亞洲人群中，5種遺傳模型下各研究間均無顯著的異質性，故均采用固定效應模型進行分析。結果顯示，在亞洲人群中，純合子模型、雜合子模型和顯性模型下，rs4986938位點多態(tài)性與RSA易感性有關(均P<0.05)，GG和GA攜帶者患RSA的風險較高；但是在等位基因模型和隱性模型狀態(tài)下，rs4986938位點多態(tài)性與RSA易感性無相關性(均P>0.05)。在高加索和非洲人群中，5種遺傳模型下rs4986938位點多態(tài)性和RSA易感性均無相關性(均P>0.05)。見表4。

表4 ESRβ基因rs4986938位點多態(tài)性與RSA易感性關系的Meta分析結果

2.3.3 ESRβ基因 rs1256030位點多態(tài)性與RSA的關系：兩項研究[8-9]評估了rs1256030位點多態(tài)性與RSA的關系。在5種遺傳模型下各研究間無異質性，故均采用固定效應模型分析。結果顯示，在5種遺傳模型下，rs1256030位點多態(tài)性與RSA的發(fā)生均無關(均P>0.05)。見表5。

表5 ESRβ基因 rs1256030位點多態(tài)性與RSA易感性關系的Meta分析結果

2.4 敏感性分析及發(fā)表偏倚評估 在剔除不符合HWE的研究[8-10]后，效應值并沒有發(fā)生翻轉，所以本研究并未將其排除。在逐一排除其余各項研究后，研究整體的效應值無顯著改變，表明研究結果具有良好的穩(wěn)定性。由于納入的原始研究數量不足10項，利用漏斗圖法檢測發(fā)表偏倚的誤差較大，所以本研究沒有利用漏斗圖法對發(fā)表偏倚進行評估。

3 討 論

RSA是導致妊娠失敗的常見原因之一，且病因十分復雜。明確其發(fā)病機制能夠更好地指導疾病的預防和臨床治療，但是截至目前，RSA的發(fā)病機制仍不清楚。在過去的十幾年里，包括ESRβ基因在內的很多基因被證實和RSA的發(fā)生相關。在亞洲人群、高加索人群和非洲人群中，均有研究報告ESRβ基因多態(tài)性和RSA易感性的關聯(lián)性，但是得到的結果存在很大差異[5，9-12]。

薈萃分析可以克服單一研究樣本量有限和研究對象代表性差的缺陷。本研究通過收集并整合現(xiàn)有文獻，發(fā)現(xiàn)在亞洲人群中ESRβ基因的rs1256049、rs4986938位點多態(tài)性和RSA的發(fā)生有關(均P<0.05)，其中rs1256049位點的GG攜帶者發(fā)生RSA的風險較低，rs4986938位點的GG和GA攜帶者發(fā)生RSA的風險較高；但是rs1256030位點多態(tài)性與RSA的發(fā)生并無相關性(P>0.05)。此外，在高加索和非洲人群中，ESRβ基因各位點多態(tài)性和RSA的發(fā)生均無相關性(P>0.05)，分析可能有如下原因：(1)納入的高加索和非洲研究對象和數量較少，統(tǒng)計學檢驗效能有限，不足以檢測到兩者的關聯(lián)性；(2)亞洲人群和非洲人群、高加索人群的遺傳背景不同，這也可能導致ESRβ基因多態(tài)性和RSA發(fā)生具有一定的種族特異性[13]。具體是哪種原因導致高加索和非洲人群的陰性結果，仍需要進一步研究。

女性生殖系統(tǒng)的正常生理功能主要由下丘腦-垂體-卵巢軸調控，ESRβ廣泛參與下丘腦-垂體-卵巢軸的生理活動[12]。Couse等[14]發(fā)現(xiàn)ESRβ能夠增加子宮頸對雌二醇的敏感性，后者會促進子宮頸的發(fā)育和成熟，這對分娩和蛻膜至關重要。敲除ESRβ基因的雌性小鼠會出現(xiàn)子宮發(fā)育異常、卵泡生成和排卵功能障礙等嚴重的生殖功能缺陷，進而導致生育能力顯著降低[15]。Zulli等[16]的研究表明，ESRβ基因多態(tài)性和女性不孕癥有關。Aléssio等[17]也發(fā)現(xiàn)，ESRβ基因多態(tài)性與血流動力學改變、血栓的形成有顯著關聯(lián)，而后兩者也是導致妊娠終止的危險因素之一。Rs1256049、rs4986938和rs1256030是ESRβ基因最為常見和廣泛研究的多態(tài)性位點。這3個位點的多態(tài)性雖然不會引起其編碼的氨基酸序列的改變，但是這些多態(tài)性可能是連鎖不平衡的，會影響基因的表達和轉錄后調控，從而在RSA的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

盡管本文對現(xiàn)有的研究結果進行了合并和分析，擴大了總體的樣本量，但是仍存在一些局限性需要克服：(1)本研究納入的原始研究主要在亞洲人群中開展，關于高加索和非洲人群的研究數量較少，因此，本研究的結果不一定能反映高加索和非洲人群的真實情況；(2)同其他復雜疾病類似，RSA的發(fā)生是由一系列的位點-位點、基因-基因、基因-環(huán)境之間的相互作用共同決定的，本研究只對ESRβ基因3個常見的多態(tài)性位點進行了單獨分析，這可能會放大或掩蓋單一位點的作用；(3)納入研究對RSA的定義并不一致，這就可能導致選擇偏倚的發(fā)生；(4)本研究只對4個英文數據庫和兩個中文數據庫進行了系統(tǒng)檢索，收錄在其他數據庫的文獻可能會被遺漏。

綜上所述，在亞洲人群中ESRβ基因的rs1256049、rs4986938位點和RSA的發(fā)生有關，其中rs1256049位點的GG攜帶者發(fā)生RSA的風險較低，rs4986938位點的GG和GA攜帶者發(fā)生RSA的風險較高?？紤]到本研究存在的缺陷，還需要在更大規(guī)模的人群，特別是高加索和非洲人群中開展大樣本的研究，進一步驗證本研究的結果。