薛新梅，齊萌，陶大勇

（塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300）

棘球蚴病(Echinococcosis)又稱包蟲病，是由棘球絳蟲(Echinococcus)的幼蟲棘球蚴(Echinococcus cyst)寄生于人畜體內(nèi)引起的一種嚴重危害人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人畜共患寄生蟲病。目前公認的棘球?qū)俳{蟲有4個種，而我國主要是細粒棘球絳蟲（E.granulosus）[1]。該病呈世界分布，廣泛流行于亞洲、拉丁美洲、南歐、大洋洲及冰島等畜牧業(yè)發(fā)達的國家及地區(qū)，主要以發(fā)展中國家流行強度較高[2,3]。在我國主要以新疆、云南、陜西、青海、甘肅、西藏、寧夏、內(nèi)蒙古和四川西部等地區(qū)流行為主，嚴重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康，造成巨大的經(jīng)濟損失[4,5]。近年來由于分子生物學(xué)在寄生蟲領(lǐng)域的應(yīng)用，能夠在基因水平上進行細粒棘球蚴病的診斷。應(yīng)用PCR測定線粒體細胞色素c氧化酶亞基1（Cytochrome c oxidase subunit 1,COx1）基因的序列可用于鑒定細粒棘球蚴的基因變異，并可作為細粒棘球蚴進化變異的指示器，因此許多學(xué)者常常把其作為細粒棘球蚴的基因分型、進化關(guān)系分析和重新分類等的重要依據(jù)[6,7]。

和靜縣作為畜牧業(yè)大縣，牲畜存欄104.3萬頭（只），其中羊存欄88.5萬只，已成為新疆現(xiàn)代畜牧業(yè)的重要組成部分，因此肝包蟲的防控顯得日益重要。為了弄清新疆和靜縣綿羊細粒棘球蚴病的感染情況及其流行株基因分型，筆者于2019年9～10月對來源于新疆和靜縣屠宰場1 115只1歲以上綿羊采取剖檢的方法進行了細粒棘球蚴病的感染情況調(diào)查和統(tǒng)計，并對隨機分離的10個包囊病灶利用線粒體細胞色素氧化酶基因1（mtCO1）通過PCR擴增、克隆測序的方法進行了細粒棘球蚴流行株的基因分型，以確定和靜縣綿羊細粒棘球蚴的感染情況和主要流行基因型，為該地區(qū)綿羊細粒棘球蚴病的科學(xué)防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 取樣地區(qū)概述

和靜縣隸屬于新疆巴音郭楞蒙古自治州，位于巴音郭楞蒙古自治州西北部，下轄1個區(qū)公所（巴音布魯克區(qū)公所）、4個鎮(zhèn)、8個鄉(xiāng)，其中農(nóng)區(qū)有5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)、牧區(qū)有7個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，擁有草場面積達214.79萬hm2，是全國面積最大的高山天然草原。

1.2 病例來源

來源于2019年9～10月和靜縣屠宰場屠宰綿羊（主要來自和靜縣農(nóng)區(qū)和牧區(qū)）。

1.3 主要儀器及試劑

離心機和PCR儀，購自Eppendorf中國有限公司；JY系列電泳儀，購自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，購自BioRad公司；組織DNA提取試劑盒、Taq plus DNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、瓊脂糖、DNAMarker及其他生化試劑，購自上海生物工程公司；pMD18-T載體，購自大連TaKara公司；大腸桿菌 (E.coli) DH5α感受態(tài)細胞，石河子大學(xué)寄生蟲實驗室提供。

1.4 病原學(xué)檢測

進行剖解檢查：待羊屠宰后，取出肝、肺等臟器，經(jīng)肉眼觀察和觸摸仔細檢查肝臟和肺臟表面有無棘球蚴包囊，并記錄綿羊的來源地和細粒棘球蚴的感染數(shù)，然后將帶有棘球蚴包囊的臟器帶回實驗室。

1.5 病料的采集及DNA的提取

從和靜縣屠宰場收集感染細粒棘球蚴綿羊的臟器，以一只羊肝臟或肺臟臟器的包囊為一份陽性病料，用5mL注射器共抽取10份感染病料囊液于1.5mL EP管中，8 000r/min離心8min，將上清液置于-20℃保存，將含有原頭細粒棘球蚴的樣品用TIANamp UenomicDNA Kit提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR擴增及測序

以提取的基因組DNA為模板，依據(jù)文獻報道的目的基因進行測試[8]，引物由北京六合華大基因生物公司合成。首先擴增線粒體細胞色素氧化酶基因1（mtCO1）。mtCO1上游引物：5'- TTT TTT GGG CAT CCT GAG GTT TAT-3'，mtCO1下游引物：5'-TAA AGA AAG AAC ATA ATG AAA ATG-3'；采用20μL反應(yīng)體系：ddH2O 9μL，2×PCR Mix 8μL，模板2μL，上、下游引物各0.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸35s，38個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物中的目的片段，并與載體pMD19-T在4℃條件下過夜連接；12h后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E.coliDH5α感受態(tài)細胞中。在氨芐青霉素平板上進行篩選，然后做菌液PCR反應(yīng)，進一步篩選驗證。將驗證正確的重組載體產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司測序，以確定在新疆和靜縣流行的細粒棘球蚴的基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊細粒棘球蚴感染情況

經(jīng)對2019年9～10月和靜縣屠宰場屠宰的1 115只綿羊細粒棘球蚴病的感染情況進行調(diào)查和統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)有88只綿羊臟器表面有棘球蚴包囊，感染率為7.89%，其中來自農(nóng)區(qū)的綿羊感染率為3%（10/331），來自牧區(qū)的綿羊感染率為9.9%（78/784），見表1。

表1 綿羊細粒棘球蚴的感染情況

2.2 細粒棘球蚴mtCOl基因的PCR擴增結(jié)果

通過mtCO1引物PCR擴增后的目的基因產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得特異性的PCR產(chǎn)物，片段長度為446bp（圖1）。克隆轉(zhuǎn)化后，隨機挑取單菌落，做菌液PCR篩選驗證，成功得到陽性轉(zhuǎn)化子（圖2）。

圖1 細粒棘球蚴mtCO1基因的PCR擴增結(jié)果

圖2 菌液PCR擴增結(jié)果

2.3 細粒棘球蚴mtCO1基因的序列比對分析

經(jīng)測序，新疆和靜縣綿羊細粒棘球蚴線粒體細胞色素氧化酶基因1（mtCO1）的片段長度為446 bp。對10個綿羊細粒棘球蚴流行株的mtCO1基因序列通過NCBI中的Blast功能比對，發(fā)現(xiàn)與登錄號為KT446001.1、KT968706.1、HF947595.1的同源性為99%～100%，證實新疆和靜縣綿羊細粒棘球蚴流行株基因型為G1型。

3 討論

細粒棘球絳蟲自1905年我國青島首次報道以來，國內(nèi)外學(xué)者對其感染情況進行了大量調(diào)查研究。Kamal等于2011年對非洲蘇丹地區(qū)待屠宰的4 378只綿羊的細粒棘球蚴感染情況進行了調(diào)查統(tǒng)計，結(jié)果顯示有26只綿羊感染，感染率為0.6%[9]。宋雪梅于2013年8～11月對新疆塔城地區(qū)沙灣縣屠宰場屠宰的1 040只綿羊細粒棘球蚴病感染情況進行了調(diào)查統(tǒng)計，結(jié)果顯示綿羊棘球蚴平均感染率為4.3%[10]。本研究通過對和靜縣源自農(nóng)區(qū)和牧區(qū)的綿羊進行細粒棘球蚴感染情況調(diào)查統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)來自牧區(qū)的綿羊細粒棘球蚴病感染率為7.89%，明顯高于農(nóng)區(qū)感染率的3%。分析其原因，可能與綿羊飼養(yǎng)方式有關(guān)。根據(jù)走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，牧區(qū)多以放牧的形式進行飼養(yǎng)，由于羊群數(shù)量龐大，常伴有牧羊犬看護，牧羊犬往往造成驅(qū)蟲給藥預(yù)防不及時，再加上防控意識缺乏，常有牧民把感染包蟲囊的內(nèi)臟給牧羊犬吞食；最后由于放牧區(qū)域經(jīng)常轉(zhuǎn)場，加大了其傳播風(fēng)險。而農(nóng)區(qū)多以圈養(yǎng)形式飼養(yǎng)，降低了以上感染風(fēng)險。針對這一現(xiàn)狀，建議采取以下措施來控制和靜縣牧區(qū)包蟲病的流行：①加強牧區(qū)包蟲病的預(yù)防工作；②對包蟲病感染臟器進行無害化處理，嚴格控制其流向牧羊犬；③定期對牧羊犬進行驅(qū)蟲，并對糞便進行深埋處理；④加強和普及綿羊細粒棘球蚴的疫苗免疫工作，并及時做好監(jiān)測；⑤控制牧羊犬的數(shù)量。由于犬作為細粒棘球絳蟲的終末宿主，糞便中的蟲卵量很大，易污染牧場環(huán)境，因此應(yīng)將和靜縣包蟲病的防控重點放在牧羊犬數(shù)量的控制上，從而有效控制包蟲病在人畜間的流行[11]。

養(yǎng)羊業(yè)是新疆和靜縣畜牧業(yè)的主要經(jīng)濟支柱，由于草場資源豐富，多選擇放牧的形式飼養(yǎng)，使該地區(qū)成為人畜包蟲病的高發(fā)區(qū)。近些年來，國外學(xué)者借助分子生物學(xué)方法以及細粒棘球蚴絳蟲基因組的特征，把其分為10種（G1-G10），其中G1為最常見的綿羊株[12,13]。Vural等對土耳其綿羊源細粒棘球蚴分離株樣品進行擴增測序，發(fā)現(xiàn)G1型基因廣泛存在于綿羊體內(nèi)，且同時發(fā)現(xiàn)G3型[14]。張學(xué)勇等對青海天峻地區(qū)16份綿羊源和2份人源細粒棘球蚴分離株樣品進行COx1基因PCR擴增、測序，發(fā)現(xiàn)人和綿羊細粒棘球蚴流行株的基因型均屬于G1型[15]。本研究對源自新疆和靜縣農(nóng)區(qū)和牧區(qū)的10份綿羊細粒棘球蚴分離株樣品進行了線粒體細胞色素氧化酶基因1（mtCO1）的擴增、克隆測序，通過NCBI中的Blast功能比對發(fā)現(xiàn)，和靜縣綿羊細粒棘球蚴流行株均為G1型，未發(fā)現(xiàn)其他型，這可能與采樣基數(shù)偏少有關(guān)。確定和靜縣綿羊細粒棘球蚴流行株的基因型，為該地區(qū)綿羊包蟲病防控工作和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了科學(xué)依據(jù)以及數(shù)據(jù)支持。