（西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西昌 615000）

T細(xì)胞作為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，若想發(fā)揮其功能，就需要兩種信號(hào)的刺激來(lái)使其活化。第一種刺激是T細(xì)胞抗原受體與抗原肽-MHC復(fù)合物的特異性結(jié)合，第二種刺激是抗原提呈細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體作用提供的共刺激信號(hào)[1]。在這兩種信號(hào)中，僅憑第一種信號(hào)無(wú)法引起細(xì)胞因子的分泌，也無(wú)法引起T細(xì)胞的增殖。而第二種信號(hào)，即共刺激信號(hào)，雖是非抗原依賴性的，但它決定了接受第一種信號(hào)后的T細(xì)胞到底是開(kāi)始活化增殖還是轉(zhuǎn)為無(wú)能[2]，對(duì)T細(xì)胞的功能表達(dá)具有至關(guān)重要的作用。B7家族分子是主要的共刺激分子，而CD80、CD86是B7家族分子的重要成員，也是近年來(lái)受到關(guān)注較多的成員。CD28、CTLA-4都是T細(xì)胞表面的受體，但CD80、CD86與它們結(jié)合后產(chǎn)生的效果卻截然不同。前一種受體可以刺激T細(xì)胞活化，而后一種受體則會(huì)抑制T細(xì)胞活化[3]。熒光定量PCR作為一種新的定量試驗(yàn)技術(shù)相比于傳統(tǒng)PCR有更多的優(yōu)點(diǎn)，它不僅可以完成對(duì)DNA模板的定量檢測(cè)，而且靈敏度更高、特異性更好、更加可靠，且沒(méi)有氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)[4]。目前已有很多關(guān)于使用熒光定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞因子的研究[5～9]。本研究旨在建立一種特異性強(qiáng)的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法，通過(guò)該方法能快捷檢測(cè)牛共刺激分子CD80、CD86，為抗病毒相關(guān)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取健康牛新鮮的脾臟，加適量生理鹽水后攪碎，靜置，取上層液體，小分裝-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒和2×SG Fast qPCR Master Mix，均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；2×Taq Plus PCR MasterMix，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；PCR儀，為Eppendorf公司的Mastercycler nexus系列產(chǎn)品；熒光定量PCR儀，為德國(guó)Analytik Jena公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank牛CD80、CD86的基因序列，分別設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1），由上海生工生物工程股份有限公司完成引物合成。

表1 引物序列、大小及退火溫度

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.4.1 總RNA提取

取300μL牛脾臟組織懸浮液樣品，10 000rpm離心3min，取上清300μL加至干凈的1.5mL EP管中，再向其中加入500μL Trizol，充分混勻，剩余步驟參照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄

用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行總RNA的反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為：5μL總RNA，2μL特異性引物（10 pmol），5μL RNase free ddH2O，輕輕混勻后離心3～5s，反應(yīng)混合物在65℃溫浴5min后，冰浴30s，然后離心3～5s。將反應(yīng)管冰浴，再加入4μL 5×Reaction Buffer，1μL RNase inhibitor（40U/μL），2μL dNTP Mix(10mmol/L)，1μL M-MuLV RT(200U/μL)，組成20μL體系。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?2℃ 60min；70℃10min；15℃保存。

1.4.3 CD80、CD86的PCR擴(kuò)增

將得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為：12.5μL 2×Taq PCR MasterMix，9.5μL ddH2O，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，2.0μL cDNA組成25μL體系。PCR程序?yàn)椋?4℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 5min；4℃保存。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建及鑒定

PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠，按膠回收試劑盒回收DNA片段。將純化的DNA片段連接于pMD18-T載體上，再加入到TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆于含有抗生素的液體LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送往上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 CD80、CD86標(biāo)準(zhǔn)品濃度、純度測(cè)定及初始拷貝數(shù)計(jì)算

測(cè)定CD80、CD86標(biāo)準(zhǔn)品的濃度、純度，選用1.8＜A260/A280＜2.0的CD80、CD86標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋后置于-20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式[10]，計(jì)算CD80、CD86的拷貝數(shù)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

選取7個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光定量PCR反應(yīng)體系為：10μL 2×SG Fast qPCR Master Mix，2μL DNF Buffer，0.4μL10mM上游引物，0.4μL 10mM下游引物，5.2μL ddH2O，2μL模板 DNA。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3min；95℃ 5s，退火溫度30s，72℃ 10s，共40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的最后一步收集熒光信號(hào)計(jì)算Ct值，根據(jù)Ct值及其對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性試驗(yàn)

用熒光定量PCR儀對(duì)每次試驗(yàn)的熒光定量PCR產(chǎn)物作熔解曲線，觀察熔解曲線是否為單一的特異峰，若曲線為單一的特異峰則表明該方法特異性良好。熔解曲線設(shè)置為：初始溫度60℃，終點(diǎn)溫度95℃，每步溫度變量1℃，平衡時(shí)間15s。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

從已經(jīng)制備好的標(biāo)準(zhǔn)品中任意選取3個(gè)梯度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。間隔1d以同樣的方法再重復(fù)一次試驗(yàn)，共重復(fù)3次，作為組間重復(fù)性試驗(yàn)。計(jì)算變異系數(shù)，分析離散程度，評(píng)價(jià)該方法的穩(wěn)定性。若變異系數(shù)小于5%[11]，則證明所建立的熒光定量PCR方法穩(wěn)定性良好。

1.8 敏感性試驗(yàn)

選取濃度為101～104copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR，判斷其敏感性。如果所檢測(cè)樣品在40個(gè)循環(huán)內(nèi)的Ct值＞0，則判定為陽(yáng)性[12]。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建及鑒定結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)可知，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到的CD80大小應(yīng)為114bp，CD86大小應(yīng)為112bp。試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)下看到的條帶如圖1，與預(yù)期條帶一致。陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序所得序列與參考序列比較，結(jié)果顯示同源性為100%，所得片段為目的片段。

圖1 CD80、CD86 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.1.2 CD80、CD86標(biāo)準(zhǔn)品濃度、純度及拷貝數(shù)

測(cè)定CD80、CD86的濃度、純度，選用1.8＜A260/A280＜2.0的CD80、CD86進(jìn)行10倍倍比稀釋，將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品保存于-20℃?zhèn)溆?。本試?yàn)中最后選用的CD80的OD260＝0.339，A260/A280＝1.88；CD86的OD260＝0.321，A260/A280＝1.82。根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式計(jì)算拷貝數(shù)，得CD80的初始拷貝數(shù)為1.379×1020copies/μL，CD86初始拷貝數(shù)為1.329×1020copies/μL。

2.2 CD80、CD86標(biāo)準(zhǔn)曲線

選取拷貝數(shù)為1012～1018copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR，得到CD80、CD86的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線（見(jiàn)圖2），根據(jù)得到的Ct值及其對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖3）。結(jié)果顯示見(jiàn)表2。

表2 CD80、CD86標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)結(jié)果

由表2可知，試驗(yàn)所得的相關(guān)系數(shù)均大于0.984，表明所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。CD80的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=-3.14x+64.66；CD86的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=-2.96x+61.13（y表示Ct值，x表示樣品濃度對(duì)數(shù)）。

圖2 CD80、CD86熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

CD80、CD86的特異性試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，熔解曲線顯示為單一的特異峰，CD80的Tm值在80.4～80.8℃范圍內(nèi)，CD86的Tm值在80.2～80.9℃范圍內(nèi)，表明建立的熒光定量PCR方法特異性良好。

圖4 CD80、CD86熔解曲線

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

選拷貝數(shù)為1016～1018copies/μL的3個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行組間及組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算其變異系數(shù)。結(jié)果顯示（見(jiàn)表3、表4）無(wú)論是CD80還是CD86，它們的所有重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均在4.71%以內(nèi)，表示建立的熒光定量PCR方法穩(wěn)定性良好。

表3 CD80重復(fù)性試驗(yàn)

表4 CD86重復(fù)性試驗(yàn)

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

選拷貝數(shù)為101～104copies/μL的4個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)所建立的方法的敏感性。試驗(yàn)結(jié)果如圖5。結(jié)果顯示在濃度為10copies/μL時(shí)，CD80、CD86熒光定量PCR均有擴(kuò)增曲線，且在40個(gè)循環(huán)內(nèi)的Ct值＞0，故所建立的熒光定量PCR方法檢出下限為10copies/μL，敏感性較高。

圖5 CD80、CD86敏感性試驗(yàn)

3 討論

CD80、CD86是刺激T細(xì)胞活化的一對(duì)共刺激分子，位于抗原提呈細(xì)胞表面，是B7家族的主要成員。CD80、CD86通過(guò)與T細(xì)胞表面的受體CD28結(jié)合來(lái)傳遞信息刺激T細(xì)胞活化，同時(shí)它們也可以與T細(xì)胞表面的抑制性受體CTLA-4結(jié)合從而抑制T細(xì)胞過(guò)度擴(kuò)增。當(dāng)有限的CD80、CD86表達(dá)時(shí)，因?yàn)镃D80、CD86對(duì)CTLA-4的親和力更高，故CD80、CD86主要與CTLA-4結(jié)合，抑制T細(xì)胞的進(jìn)一步活化。而當(dāng)大量的CD80、CD86表達(dá)時(shí)，因?yàn)镃TLA-4的表達(dá)水平有限，CD28與CD80、CD86的結(jié)合逐漸變?yōu)橹饕厔?shì)，從而進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞的活化增殖[13]。所以可以通過(guò)研究CD80、CD86的表達(dá)量來(lái)了解免疫過(guò)程[14]。故本研究建立了一種檢測(cè)CD80、CD86的熒光定量PCR方法，為抗病毒相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中核酸拷貝數(shù)最敏感和最準(zhǔn)確的方法，與傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法相比，熒光定量PCR不僅更加準(zhǔn)確、快速，而且可以對(duì)被檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，擁有其他方法不具備的優(yōu)勢(shì)，故可借助此方法研究CD80、CD86表達(dá)量的變化。

在本次試驗(yàn)中采用的是SYBR GreenⅠ熒光定量PCR。為減少干擾因素的影響，在熒光定量PCR后進(jìn)行熔解曲線的繪制，通過(guò)熔解曲線來(lái)分析所建立的方法的特異性。當(dāng)熔解曲線只有一個(gè)特異峰時(shí)表明所建立方法特異性良好，無(wú)引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。試驗(yàn)結(jié)果顯示CD80、CD86的熔解曲線均只有一個(gè)特異峰，表明所建立的熒光定量PCR方法特異性良好，無(wú)引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。

為了驗(yàn)證所建立的方法的穩(wěn)定性，保證方法的可重復(fù)性，對(duì)所建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算、分析其變異系數(shù)，當(dāng)變異系數(shù)小于5%時(shí)表明建立的方法穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示CD80、CD86熒光定量PCR的所有重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均在4.7%以內(nèi)，所以建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法穩(wěn)定性良好。

熒光定量PCR技術(shù)是目前檢測(cè)樣品中核酸拷貝數(shù)最敏感的方法，為檢測(cè)本試驗(yàn)所建立的熒光定量PCR方法的敏感性，取拷貝數(shù)為101～104copies/μL的4個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR，如果所檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品在40個(gè)循環(huán)內(nèi)的Ct值＞0，則認(rèn)為所建立的熒光定量PCR方法在該拷貝數(shù)時(shí)仍能檢測(cè)出目標(biāo)因子。結(jié)果顯示在濃度為10copies/μL時(shí)熒光定量PCR仍有擴(kuò)增曲線，且在40個(gè)循環(huán)內(nèi)的Ct值＞0，故所建立的熒光定量PCR方法檢出下限為10copies/μL，敏感性較高。

本次試驗(yàn)所建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法特異性、穩(wěn)定性良好，敏感度較高，為抗病毒研究提供了技術(shù)平臺(tái)。