王偉杰 劉恩令 魏靖文 李亞光 張煒悅

華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院婦產(chǎn)科 河北唐山 063000

ERP29(endoplasmic reticulum protein 29；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29)作為一種新型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)移等方式影響腫瘤細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[1]，實(shí)驗(yàn)證明ERP29的異常表達(dá)參與胰腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]，但ERP29對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。mTOR通路是人類惡性腫瘤中最常見(jiàn)的異常信號(hào)通路，通過(guò)激活蛋白質(zhì)翻譯及合成的關(guān)鍵因子影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡以及代謝，參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[3-4]。研究顯示近60%的卵巢癌患者中mTOR信號(hào)通路被過(guò)度激活[5]。mTOR通路相關(guān)蛋白在卵巢惡性腫瘤中高表達(dá)并與化療耐藥相關(guān)[6-7], 表明mTOR通路是治療卵巢癌的關(guān)鍵信號(hào)通路。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默EPR29基因，探討干擾前后mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)差異，以及沉默ERP29基因?qū)β殉舶㏒KOV3細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響，探討ERP29通過(guò)mTOR信號(hào)通路在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 卵巢癌SKOV3細(xì)胞株購(gòu)自于上海富衡生物科技有限公司，Lipfectamin2000購(gòu)自Invitrogen公司，考馬斯亮藍(lán)試劑盒購(gòu)于Solarbio公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TAKARA公司,CCK-8試劑盒購(gòu)于南京萊富賽生物科技有限公司，AnnexinV FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，特異性siRNA-ERP29序列及其陰性對(duì)照序列購(gòu)于上海吉瑪公司，ERP29、AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1抗體購(gòu)自于abcam公司，p4EBP1抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，羊抗兔二抗、β-actin 抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1siRNA-ERP29細(xì)胞轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞 SKOV3細(xì)胞采用含10%胎牛血清，1%雙抗(青鏈霉素混合液)的RMPI-1640培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2的溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取生長(zhǎng)密度大約90%SKOV3細(xì)胞，消化并計(jì)數(shù)，取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入1mL含5×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(NC siRNA)及實(shí)驗(yàn)組(siRNA-ERP29)，37℃、5%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟按照Lipfectamin2000說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。

1.2.2siRNA-ERP29細(xì)胞模型的構(gòu)建 RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞ERP29mRNA表達(dá)，空白組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組ERP29mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.075±0.079、1.014±0.033及0.444±0.022,實(shí)驗(yàn)組與空白組、對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示siRNA-ERP29細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

1.2.3Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1、p4EBP1蛋白表達(dá)情況 RIPA裂解液裂解各組SKOV3細(xì)胞并提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各細(xì)胞樣本蛋白含量，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液, 95℃變性10分鐘。SDS-PAGE 進(jìn)行電泳分離后，采用半干轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)膜方式轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上，室溫、緩慢搖動(dòng)狀態(tài)下封閉1小時(shí)，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3次，每次 10分鐘, 后加入二抗孵育1小時(shí)，PBST洗3次，每次 10分鐘，曝光、洗片并用image J軟件分析灰度值。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力 將各組SKOV3細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后制成1～5×104個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液。分別取100μL至96孔培養(yǎng)板，每種細(xì)胞接種3個(gè)孔作為復(fù)孔， 37℃培養(yǎng)過(guò)夜。分別在0、48小時(shí)后按1:10 體積比混合CCK-8和無(wú)血清必需基本培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)，酶標(biāo)儀測(cè)定記錄450nm波長(zhǎng)吸光度(OD)值。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力 各組SKOV3細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，取8×105個(gè)細(xì)胞分入35mm2培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，記號(hào)筆于培養(yǎng)皿底部畫(huà)線標(biāo)記，用槍頭垂直于記號(hào)筆標(biāo)記劃去盤(pán)中細(xì)胞，用PBS 沖洗去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在0、24小時(shí)分別拍照，記錄劃痕面積。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾后各組細(xì)胞凋亡情況 各組SKOV3細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，按照每孔30萬(wàn)的密度接種到6孔板中，每組細(xì)胞接種3個(gè)復(fù)孔，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，取10萬(wàn)重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，加入400μLAnnexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞， 加入5μLAnnexin V-FITC，輕輕混勻，4℃避光孵育15分鐘后加入10μLPI染色液，輕輕混勻，4℃避光孵育5分鐘。進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1、p4EBP1蛋白表達(dá)情況 如表1、圖1所示，3組SKOV3細(xì)胞AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1、p4EBP1蛋白表達(dá)比較，實(shí)驗(yàn)組 pAKT、pmTOR、p4EBP1蛋白表達(dá)較空白組及陰性對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白組及陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而3組細(xì)胞AKT、mTOR、4EBP1蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 3組細(xì)胞AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1、p4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)比較

圖1 各組細(xì)胞AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1、p4EBP1蛋白表達(dá)

2.2CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾后各組細(xì)胞增殖能力 如表2所示，空白組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染完成后0小時(shí)的OD值分別為(0.302±0.003)、(0.305±0.004)、(0.303±0.008)，48h的OD值分別為(0.567±0.008)、(0.572±0.003)及(0.606±0.007)，實(shí)驗(yàn)組較空白組及對(duì)照組相比增殖能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 3組細(xì)胞OD值

2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾后各組細(xì)胞侵襲能力 如圖2、表3所示，空白組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組劃痕愈合率分別為(0.437±0.018)、(0.427±0.019)、(0.708±0.06)，實(shí)驗(yàn)組較空白組及對(duì)照組相比侵襲能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾后各組細(xì)胞侵襲能力

表3 3組細(xì)胞劃痕愈合率

2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾后各組細(xì)胞凋亡情況 如圖3、表4所示，空白組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率(%)分別為(1.83±0.305)、(1.87±0.493)、(1.20±0.100)，空白組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組晚期凋亡率(%)分別為(2.10±0.954)、(1.63±0.776)、(0.90±0.400)，實(shí)驗(yàn)組較空白組及對(duì)照組相比凋亡率下降，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖3 干擾后各組細(xì)胞凋亡情況

表4 3組細(xì)胞早期及晚期凋亡率

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的膜性系統(tǒng)，具有大量促進(jìn)蛋白合成、分泌以及維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能穩(wěn)定狀態(tài)的分子伴侶蛋白，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)破壞會(huì)引起細(xì)胞DNA的損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生[8]。ERP29作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白由N端和C端域組成,N端結(jié)構(gòu)域有助于ERP29的二聚化，C端結(jié)構(gòu)域有助于底物結(jié)合和分泌[1]。大多學(xué)者認(rèn)為ERP29作為抑癌基因與腫瘤的發(fā)展呈負(fù)相關(guān)[9]，實(shí)驗(yàn)表明敲除腫瘤細(xì)胞ERP29基因可導(dǎo)致上皮生物標(biāo)記E-鈣粘蛋白顯著減少、波形蛋白顯著增加，表明ERP29通過(guò)參與上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[10]，有研究提示ERP29的表達(dá)與卵巢癌的化療敏感性呈負(fù)相關(guān)[11]。但亦有實(shí)驗(yàn)表明ERP29在肺癌組織中高表達(dá)[12]，表明ERP29在不同組織、不同細(xì)胞中發(fā)揮著不同作用。

mTOR通路是人類惡性腫瘤中最常見(jiàn)的異常信號(hào)通路，主要由磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等組成,其通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬、侵襲及遷移等影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。PI3K被生長(zhǎng)因子等激活后，使磷脂酰肌醇 4，5-二磷酸(PIP2) 磷酸化生成 PIP3，PIP3 與AKT和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK1)結(jié)合，促使PDK1對(duì)AKT的活化形成pAKT，pAKT可直接磷酸化mTOR，也可以通過(guò)解除結(jié)節(jié)硬化復(fù)合物1(tsc1)對(duì)mTOR的抑制作用間接激活mTOR, 磷酸化的mTOR可進(jìn)一步激活其下游因子核糖體S6激酶-1(S6K-1)和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白-1(4EBP-1)，S6K-1結(jié)合于真核啟動(dòng)因子3(eIF3)并處于失活狀態(tài)，4EBP-1與真核轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)因子-4E(eIF)結(jié)合并抑制其活性，pmTOR磷酸化S6K-1及4EBP1，解除了對(duì)轉(zhuǎn)錄的抑制作用并促進(jìn)翻譯復(fù)合物的形成、增加蛋白質(zhì)翻譯并參與腫瘤生長(zhǎng)、增殖及腫瘤血管的生成[14-15]。mTOR通路在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，mTOR通路相關(guān)蛋白在卵巢癌組織中高表達(dá)，并且與卵巢癌患者總生存率及無(wú)進(jìn)展生存率呈負(fù)相關(guān)[16]。實(shí)驗(yàn)顯示，mTOR通路抑制劑可顯著改善晚期腫瘤患者的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間[17]，是臨床治療惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

腫瘤組織中ERP29的表達(dá)水平與mTOR信號(hào)通路的激活因子呈負(fù)相關(guān)[9]，表明ERP29作為一上游因子通過(guò)mTOR信號(hào)通路影響腫瘤進(jìn)展。本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默SKOV3卵巢癌細(xì)胞EPR29基因并檢測(cè)細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡能力的改變，Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示沉默EPR29可增強(qiáng)mTOR通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平，并且沉默EPR29后卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力增強(qiáng)，但對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡能力無(wú)顯著影響。提示ERP29可能作為一種抑癌因子在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，其機(jī)制可能與抑制mTOR通路的激活有關(guān)。