朱 妞

(西安醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院，西安 710021)

膳食纖維(DF)具有降低膽固醇、控制血糖、改善腸道功能紊亂、控制體重等一系列生理功能，對于人類健康有積極的預防作用[1-3]。全民健康是全民小康的重要前提，全民營養(yǎng)是全民健康的保證。膳食纖維作為第七營養(yǎng)素，是居民每日膳食中重要的營養(yǎng)素，在食品工業(yè)中占據(jù)重要的地位，可以廣泛應用于主食、肉制品、保健品、乳制品、飲料、保健食品、調(diào)味品、嬰幼兒食品等各個領域[4,5]。DF包含水溶性膳食纖維(SDF)和水不溶性膳食纖維(IDF)。二者的比例對膳食纖維的理化特性和生理功能影響較大[6,7]，SDF主要體現(xiàn)在控制血糖、降低膽固醇等代謝功能方面，IDF則通過一定的機械蠕動改善腸道功能。具有應用價值的DF應該至少含有10%以上的SDF[8]。我國的蘋果資源豐富，年產(chǎn)量大，陜西省是蘋果資源大省[9]。蘋果汁加工產(chǎn)生的廢棄物蘋果渣中含有豐富的膳食纖維，但是SDF不足，只占3%左右。通過微生物發(fā)酵改善蘋果渣膳食纖維的組成，提高SDF含量，才能更好體現(xiàn)膳食纖維的代謝功能特性[10]，真正變廢為寶，提升蘋果產(chǎn)業(yè)鏈附加值。

微生物發(fā)酵制備膳食纖維主要是利用菌種產(chǎn)生的纖維素酶分解纖維，提高SDF含量，目前主要采用的菌種是曲霉屬和木霉屬[11]。綠色木霉對人體無毒性，產(chǎn)纖維素酶活性非常高，降解效果好，且菌體繁殖快，被廣泛應用于食品發(fā)酵[12]。本試驗設計了綠色木霉前發(fā)酵和后發(fā)酵工藝處理蘋果渣膳食纖維。通過前發(fā)酵，綠色木霉在適宜的條件下培養(yǎng)，產(chǎn)生大量的生物酶；后發(fā)酵過程利用綠色木霉產(chǎn)生的生物酶酶解，改善蘋果渣膳食纖維組成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣：由渭南海升果業(yè)有限公司提供，清洗干燥后粉碎過40目篩；綠色木霉：沂源康源生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈣：分析純，西安化學試劑公司；瓊脂、葡萄糖：市售。

1.2 儀器與設備

玻璃儀器：錐形瓶、離心管、量筒、試管等。

QE-200型萬能粉碎機 江陰市萬通藥化機械設備有限公司；HH2-型恒溫水浴鍋 北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司；pHS-3C型精密pH計 上海大中分析儀器有限公司；JA5003型電子天平 上海精密科學儀器廠；WJ-2型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海和呈儀器制造有限公司；80001-10070型全溫型恒溫培養(yǎng)搖床 上海茸研儀器有限公司；JHT-DD型工作臺 上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵劑制備

活化培養(yǎng)基采用馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，自然pH，加蒸餾水1 L，制成馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板；發(fā)酵培養(yǎng)基：蘋果渣原粉，磷酸二氫鉀6.5 g，硫酸銨6 g，硫酸鎂2.5 g，氯化鈣1.5 g，加蒸餾水1 L；發(fā)酵劑：在 PDA培養(yǎng)基中接種綠色木霉菌種，28 ℃條件下培養(yǎng)72 h。用無菌水洗下孢子，并震蕩稀釋。采用血球計數(shù)板計數(shù)，孢子含量在107～108CFU/mL[13]。

1.3.2 綠色木霉發(fā)酵制備蘋果渣膳食纖維

將一定量蘋果渣粉加水調(diào)制混勻后，裝入錐形瓶中，于121 ℃條件下滅菌處理20 min，迅速冷卻。按照試驗需要接入不同體積的發(fā)酵液，維持試驗設計條件進行前發(fā)酵培養(yǎng)。后發(fā)酵：調(diào)節(jié)pH為5.0，溫度50 ℃，繼續(xù)發(fā)酵48 h。前后二次發(fā)酵結束后加入95%乙醇進行醇沉后將濾渣烘干，粉碎過80目篩，即為蘋果渣膳食纖維粉。

前發(fā)酵工藝條件的確定，主要采用單因素試驗和正交試驗?？疾炝弦罕?、發(fā)酵初始pH、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等因素對SDF含量的影響，設計正交試驗確定最佳前發(fā)酵工藝參數(shù)。

1.3.3 膳食纖維計算方法

本試驗膳食纖維總含量和水溶性膳食纖維含量的測定采用酶-重量法[14]。

SDF含量=水溶性膳食纖維質(zhì)量/總膳食纖維質(zhì)量×100%。

(1)

1.3.4 膳食纖維持水力和膨脹力的測定方法

準確稱取1.0 g膳食纖維粉于100 mL燒杯中，加入50 mL蒸餾水，振搖，混勻后放置于25 ℃水浴1 h。使蘋果渣膳食纖維充分吸水后過濾瀝干，而后轉移到表面皿，稱重，采用公式(2)計算膳食纖維的持水力(g/g)。

(2)

準確稱取1.0 g膳食纖維粉于100 mL量筒中，加入50 mL蒸餾水，振搖，混勻后置于室溫條件，靜置24 h。采用公式(3)計算膳食纖維的膨脹力(mL/g)。

(3)

2 結果與分析

2.1 料液比的影響

準確稱取5.0 g蘋果渣粉于250 mL錐形瓶中，按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)加入相應的培養(yǎng)基，混合均勻，調(diào)節(jié)pH為6.0，接種8%綠色木霉發(fā)酵劑，32 ℃條件下發(fā)酵2 d。測定水溶性膳食纖維和總膳食纖維，計算SDF含量，結果見圖1。

圖1 料液比對SDF含量的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on SDF content

由圖1可知，料液比會對綠色木霉的繁殖產(chǎn)生一定的影響。料液比較小時，培養(yǎng)基中水分含量少，蘋果渣與綠色木霉接觸不充分，發(fā)酵效果不理想。料液比為1∶20時，綠色木霉獲得充足的水分，和蘋果渣發(fā)酵作用較為充分，產(chǎn)生充足的菌絲和酶，發(fā)酵效果較佳。隨著料液比的增加，過多的水分會減少發(fā)酵體系的氧氣，反而不利于綠色木霉菌體生長，同時也加大了后續(xù)處理的難度。

2.2 培養(yǎng)溫度的影響

準確稱取5.0 g蘋果渣粉，加入100 mL培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH為6.0，接種8%綠色木霉發(fā)酵劑，在28，30，32，34，36 ℃的溫度下培養(yǎng)菌種2 d，計算SDF含量，結果見圖2。

圖2 培養(yǎng)溫度對SDF含量的影響Fig.2 Effect of culture temperature on SDF content

由圖2可知，適宜的溫度對綠色木霉的繁殖和發(fā)酵非常重要。32 ℃最適宜綠色木霉的繁殖，SDF含量達到最大值。溫度是影響微生物繁殖的重要因素，也影響酶的活性和各種生化反應的進行。溫度較低會抑制綠色木霉代謝產(chǎn)酶等活性，過高的溫度會減緩綠色木霉生長，減少酶的產(chǎn)生，SDF含量顯著降低。參考其他研究成果，綠色木霉適宜的溫度均在32 ℃左右，與該結論基本一致，因此后續(xù)試驗選擇最佳綠色木霉培養(yǎng)溫度為32 ℃。

2.3 發(fā)酵液初始pH的影響

準確稱取5.0 g蘋果渣粉，加入100 mL培養(yǎng)基，接種8%發(fā)酵劑，調(diào)節(jié)發(fā)酵液初始pH分別為5.7，6.0，6.3，6.6，6.9，于32 ℃條件下培養(yǎng)2 d，計算SDF含量，結果見圖3。

圖3 發(fā)酵液初始pH對SDF含量的影響Fig.3 Effect of initial pH value of fermentation broth on SDF content

由圖3可知，發(fā)酵液初始pH為6.0時，SDF含量達到最大值24.51%。之后隨著pH的增加，SDF含量不斷下降。一般而言，真菌適合在弱酸性條件下生存，偏酸性環(huán)境更加有利于綠色木霉的繁殖。

2.4 綠色木霉接種量的影響

準確稱取5.0 g蘋果渣粉，加入100 mL培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)發(fā)酵液初始pH 為6.0，分別接種6%、8%、10%、12%、15%綠色木霉，在32 ℃條件下培養(yǎng)2 d，計算SDF含量，結果見圖4。

圖4 綠色木霉接種量對SDF含量的影響Fig.4 Effect of inoculation amount of Trichodermaviride on SDF content

由圖4可知，隨著綠色木霉接種量的增加，SDF含量呈現(xiàn)一定的上升趨勢。隨著接種量的增加，培養(yǎng)基中綠色木霉比例增加，產(chǎn)生更豐富的酶，發(fā)酵效果有所提升。底物濃度一定的情況下，接種量的進一步增加會導致營養(yǎng)物質(zhì)不夠，繼而受到限制。因此，后續(xù)增加接種量，SDF含量增加不明顯，反而因為競爭性導致產(chǎn)酶力受到限制，SDF含量有下降趨勢。

2.5 培養(yǎng)時間的影響

準確稱取5.0 g蘋果渣粉，加入100 mL培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)發(fā)酵液初始pH 為6.0，接種8%綠色木霉發(fā)酵劑， 在32 ℃條件下分別培養(yǎng)40，48，56，64，72 h，計算SDF含量，結果見圖5。

圖5 培養(yǎng)時間對SDF含量的影響Fig.5 Effect of culture time on SDF content

由圖5可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，SDF含量整體呈現(xiàn)上升的趨勢。主要原因是菌種進入培養(yǎng)基后繁殖有一定的滯后性，隨著時間延長至64 h時，綠色木霉產(chǎn)酶活力最強，進入對數(shù)生長期，產(chǎn)生最大量的各種酶類。在后發(fā)酵階段，這些酶與蘋果渣膳食纖維充分作用，提高了SDF含量。時間繼續(xù)延長，積累的一些生化反應產(chǎn)物反而影響水溶性膳食纖維的含量。

2.6 正交試驗

按照表1進行四因素三水平正交試驗設計，在培養(yǎng)溫度為32 ℃的條件下，考察前發(fā)酵過程料液比、發(fā)酵液初始pH、綠色木霉接種量、培養(yǎng)時間4個因素對SDF含量的影響。后發(fā)酵工藝條件同上，保持不變。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

按照試驗設計，完成9組試驗，計算相應的SDF含量，正交試驗結果分析見表2。

表2 L9(34)正交試驗結果分析表Table 2 Analysis of L9(34) orthogonal test results

由表2的正交試驗結果可知，因素影響的主次順序為D>B>C>A，培養(yǎng)時間對綠色木霉的生長、產(chǎn)酶影響最大，64 h為菌種對數(shù)生長期，對后發(fā)酵提供的酶最為充足，SDF含量顯著增加。由K值可以得出優(yōu)組合為A1B2C2D2，即料液比1∶15(g/mL)，發(fā)酵液初始pH 6.0，綠色木霉接種量10%，培養(yǎng)時間64 h。此組合為試驗序號2，在此條件下平行試驗3次，取平均值，膳食纖維總得率為79.8%，SDF含量為30.27%，該膳食纖維的持水力為7.54 g/g，膨脹力為8.62 mL/g，比原蘋果渣粉(持水力2.19 g/g，膨脹力2.87 mL/g)有了很大提升。

2.7 發(fā)酵前后蘋果渣膳食纖維結構對照

將蘋果渣原粉和通過綠色木霉二次發(fā)酵所得的改性膳食纖維產(chǎn)品通過電鏡掃描，比較二者結構的改變，結果見圖6。

圖6 蘋果渣發(fā)酵前后掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrograph of apple pomace before and after fermentation

由圖6對比發(fā)現(xiàn)，蘋果渣原粉的顆粒較大，表面光滑規(guī)整，形狀規(guī)則，幾乎呈現(xiàn)圓球形。通過綠色木霉二次發(fā)酵后，膳食纖維表面粗糙，更加細膩，呈現(xiàn)蜂窩狀。結合SDF含量的增加，分析原因可能是通過發(fā)酵改性使蘋果渣膳食纖維結構更加疏松，水溶性增加，體現(xiàn)一定的立體結構，從而表現(xiàn)出更好的持水力和膨脹力。

3 小結

采用綠色木霉前發(fā)酵和后發(fā)酵二次發(fā)酵工藝對蘋果渣進行發(fā)酵處理，極大地提高了蘋果渣膳食纖維的SDF含量，總膳食纖維得率達79.8%，水溶性膳食纖維(SDF)含量可達到30.27%。此類研究報道很少，通過試驗發(fā)現(xiàn)對綠色木霉二次發(fā)酵對蘋果渣SDF含量的提升效果較佳。

通過單因素試驗和正交試驗對綠色木霉前發(fā)酵工藝進行研究，得出最佳工藝條件為：培養(yǎng)溫度32 ℃、料液比1∶15(g/mL)、發(fā)酵液初始pH 6.0、接種量10%、培養(yǎng)時間64 h，后發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度50 ℃、pH 5.0、發(fā)酵時間48 h條件不變。后續(xù)可以進一步研究后發(fā)酵工藝條件，尋找微生物發(fā)酵制備膳食纖維的優(yōu)化工藝路線。

綠色木霉二次發(fā)酵制備的蘋果渣膳食纖維持水力為7.54 g/g，膨脹力為8.62 mL/g，比原蘋果渣粉性能有了很大提升，后續(xù)應對改性膳食纖維粉進行理化特性全面分析，為改性膳食纖維在食品工業(yè)中的應用提供了參考依據(jù)。