范三紅，郭定一，張錦華，李多，白寶清*

(1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；2.特色植物資源研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(山西大學(xué))，太原 030006)

藜麥，屬藜科，原產(chǎn)于南美洲，種植歷史悠久， 因?yàn)槠錉I(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，深受當(dāng)?shù)鼐用竦南矏?，并享有“糧食之母”的美譽(yù)[1]。 現(xiàn)今，中國(guó)成為藜麥的最大種植國(guó)之一，主要分布于山西、青海、西藏等地。黃酮類物質(zhì)目前已廣泛應(yīng)用于食品和調(diào)味品等領(lǐng)域[2,3]。食品中黃酮類物質(zhì)種類豐富，含量也較高[4,5]。食品中的黃酮類化合物具有良好的抗氧化、抗炎等生理活性[6,7]，藜麥糠中黃酮含量較高，因而具有較大的研究?jī)r(jià)值[8]。

黃酮類物質(zhì)的分離純化方法有：薄層色譜法、吸附樹脂層析法等， 其中應(yīng)用較為廣泛的是大孔吸附樹脂層析法[9]。大孔吸附樹脂外形呈球狀，內(nèi)部含有許多細(xì)小的孔隙，用于有機(jī)化合物的分離純化，通過吸附性和分子篩原理而達(dá)到分離純化的目的[10]。大孔樹脂內(nèi)部呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑較大，吸附效果優(yōu)良，大孔吸附樹脂吸附技術(shù)最早用于廢水處理、醫(yī)藥工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、分析化學(xué)、臨床檢定和治療等領(lǐng)域，近年來在我國(guó)已廣泛用于中草藥有效成分的提取、分離、純化工作中[11]。

本實(shí)驗(yàn)利用大孔吸附樹脂對(duì)從藜麥糠中提取的黃酮類化合物進(jìn)行分離純化，用高效液相色譜對(duì)純化的藜麥糠黃酮類化合物進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)為藜麥糠中有效成分的分離、純化提供了實(shí)驗(yàn)支撐，為藜麥糠天然黃酮類化合物的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥糠：山西省華青藜麥產(chǎn)品開發(fā)有限公司；大孔樹脂(AB-8、D101、NKA-9、HPD750、HPD950、HPD450、X-5)：北京索萊寶科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(AR≥98%)：美國(guó) Sigma公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JP-040ST 型超聲波清洗機(jī) 深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；TG16A-WS 型高速離心機(jī) 武漢愛斯佩科學(xué)儀器有限公司；SP-2000UV 型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藜麥糠黃酮提取物的制備

精確稱取藜麥糠粉末10.0 g，于超聲溫度50 ℃、料液比1∶30(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的條件下超聲提取20 min，重復(fù)提取濾渣，合并3次濾液。將黃酮類化合物提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得藜麥糠黃酮粗提浸膏，用無水乙醇充分浸泡6 h，真空抽濾除去糖類等極性雜質(zhì)，二次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除醇，將浸膏用蒸餾水稀釋成不同質(zhì)量濃度待測(cè)液。

1.3.2 樹脂的預(yù)處理

將7種大孔樹脂分別放置于燒杯中，用95%乙醇溶液在室溫下浸漬24 h，充分飽脹樹脂。用蒸餾水緩慢洗滌樹脂至無醇味。將樹脂濕法裝柱(Ф15 mm×400 mm)，用5% HCl和5% NaOH溶液以3 BV/h速率淋洗，用蒸餾水洗至流出液pH為7后備用。

1.3.3 大孔吸附樹脂的篩選

1.3.3.1 大孔樹脂的靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸

分別稱取經(jīng)預(yù)處理的7種大孔樹脂各5 g于具塞三角瓶中，加入50 mL 2.0 mg/mL藜麥糠黃酮類化合物提取液，于HT-100恒溫振蕩搖床(25 ℃，160 r/ min)中振蕩吸附24 h后真空抽濾，測(cè)得平衡液中黃酮質(zhì)量濃度[12]。用蒸餾水緩慢將大孔樹脂表面的樣品溶液沖去，于上述樹脂中分別加入75% C2H5OH溶液50 mL振蕩解吸24 h(25 ℃，160 r/min)，測(cè)定吸附和解吸液中黃酮類化合物的質(zhì)量濃度，并根據(jù)下式分別得出各項(xiàng)指標(biāo)：

吸附量Q(mg/g)=(C0-C1)×V1/W。

(1)

吸附率A(%)=(C0-C1)/C0×100。

(2)

解吸量(mg/g)=C2×V2/W。

(3)

解吸率D(%)=(V2×C2)/(W×Q)×100。

(4)

回收率(%)=洗脫液中的黃酮含量/上柱黃酮量×100。

(5)

式中：C0為樣液黃酮濃度(mg/mL)；C1為吸附后濾液黃酮濃度(mg/mL)；C2為解吸液黃酮濃度(mg/mL)；V1為吸附液體積(mL)；V2為解吸液體積(mL)；W為干樹脂量(g)。

1.3.3.2 大孔樹脂的靜態(tài)吸附解吸動(dòng)力學(xué)[13]

按照1.3.3.1所描述的方法，于HT-100恒溫振蕩搖床(25 ℃，160 r/ min)中振蕩，每間隔1 h吸取平衡液并測(cè)定其質(zhì)量濃度，共測(cè)定8次，模擬得出樹脂的靜態(tài)吸附與解吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.4 大孔樹脂純化條件優(yōu)化[14]

1.3.4.1 樣液濃度對(duì)大孔樹脂吸附效果的影響

配制0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mg/mL的藜麥糠黃酮類化合物粗提液，將5.0 g優(yōu)選的大孔樹脂濕法裝柱。分別取各濃度藜麥糠黃酮粗提液的30 mL調(diào)節(jié)樣液pH為6.0，振蕩吸附(25 ℃，160 r/min，24 h)，柱上洗脫(2 BV，乙醇溶液75%)，并測(cè)定洗脫液的黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算回收率。

1.3.4.2 上樣量對(duì)大孔樹脂吸附效果的影響

稱取5.0 g優(yōu)選的大孔樹脂濕法裝柱。取2.0 mg/mL pH為6.0的藜麥糠黃酮溶液進(jìn)行上樣，上樣流速為3 mL/min，上樣量分別為10，12，16，20，25，27，30，35，40，45 mL，振蕩吸附后(25 ℃，160 r/min，24 h)，水洗，再用2 BV 75%乙醇溶液解吸附，測(cè)定各組洗脫液中黃酮含量，計(jì)算得出回收率。

1.3.4.3 乙醇濃度對(duì)大孔樹脂吸附效果的影響

稱取5.0 g優(yōu)選的大孔樹脂濕法裝柱。固定樣液pH為6.0，藜麥糠黃酮溶液為2.0 mg/mL，上樣量為30 mL，樣品吸附完畢后進(jìn)行水洗，分別用2 BV濃度為35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液解吸。測(cè)定各組解吸液中黃酮含量，計(jì)算得出回收率。

1.3.4.4 樣液pH對(duì)大孔樹脂吸附效果的影響

稱取5.0 g優(yōu)選的大孔樹脂濕法裝柱。取2.0 mg/mL上樣量為30 mL的藜麥糠黃酮溶液進(jìn)行上樣，上樣前用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將樣液pH值分別調(diào)節(jié)為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，11.0，振蕩吸附后(25 ℃，160 r/min，24 h)，水洗，再用2 BV 75%乙醇溶液解吸附，得不同 pH值解吸液中黃酮的質(zhì)量濃度，測(cè)定各組洗脫液中黃酮含量，計(jì)算得出回收率。

1.3.4.5 解吸液體積對(duì)大孔樹脂吸附效果的影響

對(duì)優(yōu)選的大孔樹脂濕法裝柱，裝柱量為5.0 g。固定樣液pH為6.0，藜麥糠黃酮溶液為2.0 mg/mL，再用75%的乙醇溶液以2 BV/h進(jìn)行解吸附，然后用自動(dòng)部分收集器分部收集解吸液，測(cè)得各收集管目標(biāo)溶液的質(zhì)量濃度，繪制出洗脫曲線。

1.3.5 藜麥糠黃酮分離純化前后純度的測(cè)定[15]

按照所得最優(yōu)純化條件對(duì)藜麥糠黃酮粗提物進(jìn)行吸附、解吸，測(cè)定經(jīng)純化后的黃酮濃度，解吸液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成膏狀，真空干燥到恒重，準(zhǔn)確稱量其質(zhì)量。通過下式得出藜麥糠黃酮的純度：

Y=V×C×100/M。

(6)

式中：Y為純化后黃酮的純度(%)；V為解吸液體積(mL)；C為解吸液中黃酮濃度(mg/mL)；M為干燥后黃酮的總質(zhì)量(mg)。

1.3.6 高效液相色譜分析藜麥糠黃酮樣品

準(zhǔn)確稱取經(jīng)純化、真空干燥的藜麥糠黃酮類化合物0.04 g，用色譜甲醇定容至50 mL容量瓶中備用[16]。采用安捷倫1260型高效液相色譜儀對(duì)制備的樣品進(jìn)行定性分析。

1.3.6.1 色譜條件

高效液相色譜法的工作條件：色譜柱Innoval C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A ：100%甲醇，流動(dòng)相B：1%乙酸；流速0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，進(jìn)樣量10 μL；柱溫40 ℃，梯度洗脫條件見表1。

表1 HPLC流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)間表Table 1 HPLC mobile phase gradient elution schedule

1.3.6.2 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

以甲醇溶解標(biāo)準(zhǔn)樣品得蘆丁0.040 mg/mL、槲皮素0.024 mg/mL、槲皮苷0.0200 mg/mL、異槲皮苷0.016 mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

2.1.1 大孔樹脂的靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸

由表2可知，所選7種大孔樹脂對(duì)藜麥糠黃酮類化合物的吸附、解吸效果各不相同，由于7種樹脂的表面結(jié)構(gòu)、孔徑大小、鍵合情況各異而導(dǎo)致其對(duì)藜麥糠黃酮化合物的吸附和解吸效果均有差異。其中，中極性HPD750吸附量高達(dá)2.032 mg/g，吸附率最高，達(dá)到79.20%，但其解吸率最低，只有31.49%，其解吸量為0.640 mg/g。而中極性HPD950吸附量達(dá)1.536 mg/g，吸附率達(dá)59.90%，HPD950的解吸效果明顯強(qiáng)于其余樹脂，其解吸率達(dá)86.41%，解吸量為1.327 mg/g，其余樹脂的吸附和解吸效果均較差。綜合樹脂的吸附和解吸能力可得：HPD950樹脂與藜麥糠黃酮極性最為相似，最適宜分離純化藜麥糠黃酮。

表2 大孔樹脂的吸附和解吸性能Table 2 Absorption and desorption properties of macroporous resins

2.1.2 吸附樹脂的靜態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)曲線

在前3 h內(nèi)各樹脂吸附效果較為明顯，且HPD750有較好的吸附效果，見圖1。

圖1 不同類型樹脂對(duì)藜麥糠黃酮靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Dynamic curves of static adsorption of flavonoids from quinoa chaff by different types of resins

由圖1可知，HPD750樹脂吸附速率快，吸附量高達(dá)1.833 mg/g，吸附率達(dá)到76.30%，明顯高于其他型樹脂。而中極性HPD950吸附率僅次于HPD750，達(dá)到吸附飽和點(diǎn)時(shí)，吸附量為1.336 mg/g，吸附率為57.1%。除HPD750和HPD950外，其他樹脂對(duì)藜麥糠黃酮化合物的吸附效果較差，達(dá)到吸附飽和點(diǎn)時(shí)的吸附率均低于50%。這可能是由于藜麥糠黃酮含有的羰基、縮醛式衍生物與中極性樹脂分子間作用力較強(qiáng)或產(chǎn)生氫鍵，所以中極性的樹脂對(duì)其吸附效果較好。

由圖2可知，HPD950大孔樹脂的解吸效果明顯優(yōu)于其他型大孔樹脂；在0～2 h，HPD950解吸率斜率最大，在此段時(shí)間內(nèi)，吸附在HPD950大孔樹脂上的黃酮化合物能被洗脫液高效溶出；在2～3 h時(shí)，HPD950大孔樹脂的解吸率雖有所上升，但其斜率明顯低于前2 h。在洗脫時(shí)間達(dá)到4 h后，HPD950大孔樹脂基本達(dá)到解吸平衡點(diǎn)，其解吸率達(dá)到最高。在對(duì)藜麥糠進(jìn)行靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)考察時(shí)，有較高吸附率的HPD750大孔樹脂的解吸率卻很低。在達(dá)到解吸平衡時(shí)，其解吸率低于50%，遠(yuǎn)低于HPD950型大孔樹脂，解吸附效果較差。除HPD950和HPD750大孔樹脂以外，各大孔樹脂在2 h內(nèi)快速解吸；在達(dá)到解吸平衡點(diǎn)后，各樹脂的最高解吸率均小于50%，解吸效果較差。故由各樹脂的吸附解吸動(dòng)力學(xué)曲線以及各項(xiàng)吸附解吸指標(biāo)，可確定HPD950型為最適合純化藜麥糠黃酮類化合物的大孔樹脂。

圖2 不同類型樹脂對(duì)藜麥糠黃酮靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Dynamic curves of static desorption of flavonoids from quinoa chaff by different types of resins

2.2 HPD950型樹脂對(duì)藜麥糠黃酮的條件優(yōu)化

2.2.1 樣液濃度的影響

由圖3可知，在藜麥糠黃酮化合物濃度低于2.5 mg/mL時(shí)，回收率隨樣液濃度的增加呈上升趨勢(shì)，在藜麥糠黃酮濃度達(dá)2.5 mg/mL時(shí)達(dá)到最高回收率59.80%，濃度大于2.5 mg/mL時(shí)其回收率略微減小，基本不受質(zhì)量濃度改變的影響?？芍跐舛葹?.5 mg/mL時(shí)達(dá)到樹脂的飽和吸附點(diǎn)，濃度過高不利于吸附且浪費(fèi)樣品，故HPD950樹脂純化黃酮類化合物最佳的上樣濃度為2.5 mg/mL。

圖3 不同質(zhì)量濃度藜麥糠黃酮對(duì)HPD950大孔樹脂分離純化藜麥糠黃酮的影響Fig.3 Effects of different concentration of quinoa chaff flavonoids on the separation and purification of quinoa chaff flavonoids by HPD950 macroporous resin

2.2.2 上樣量的影響

由圖4可知，當(dāng)上樣體積過小時(shí)，柱內(nèi)大孔樹脂的最大吸附量大于樣液中黃酮類化合物的量，造成吸附劑浪費(fèi)，純化效率低。當(dāng)上樣體積小于35 mL時(shí)，黃酮回收率隨著上樣體積的增加逐漸增大，當(dāng)上樣體積為35 mL時(shí)達(dá)最高回收率67.3%，此時(shí)大孔樹脂對(duì)黃酮的吸附基本接近平衡。而當(dāng)上樣體積繼續(xù)增加時(shí)，黃酮回收率略微下降，因?yàn)闃悠啡芤褐羞^量的黃酮類化合物在吸附柱上沒有被樹脂充分吸附，使樣液流失，回收率降低。上樣體積與吸附劑比例過低或過高均會(huì)使回收率降低。因此，選擇35 mL為最佳上樣體積。

圖4 樣液量對(duì)HPD950大孔樹脂分離純化藜麥糠黃酮的影響Fig.4 Effects of sample solution volume on quinoa chaff flavonoids separated and purified by HPD950 macroporous resin

2.2.3 樣液pH的影響

由圖5可知，隨著pH值的增大，黃酮回收率呈先增大后減小的趨勢(shì)。上樣液pH值對(duì)黃酮回收率的影響較為明顯。當(dāng)上樣液pH值為6.0時(shí)，藜麥糠黃酮的回收率最大，達(dá)到53.15%。pH≤4和pH≥7時(shí)，黃酮回收率均低于50%。這是由于過酸或過堿條件下處理樣品，不僅會(huì)破壞藜麥糠黃酮化合物的化學(xué)性質(zhì)，而且會(huì)影響大孔樹脂的結(jié)構(gòu)，使大孔樹脂對(duì)藜麥糠黃酮化合物的分離純化效果變差。與堿性環(huán)境相比，弱酸環(huán)境下更有助于HPD950型大孔樹脂對(duì)藜麥糠黃酮的分離純化[17]。因此，上樣液的最佳pH值為6.0。

圖5 上樣液pH對(duì)HPD950大孔樹脂分離純化藜麥糠黃酮的影響Fig.5 Effects of sample solution pH on quinoa chaff flavonoids separated and purified by HPD950 macroporous resin

2.2.4 乙醇濃度的影響

由圖6可知，乙醇濃度小于75%時(shí)，黃酮回收率隨著乙醇濃度的上升而升高，乙醇濃度大于75%時(shí)，黃酮回收率逐漸降低。因?yàn)樵诘蜐舛鹊囊掖冀馕褐?，藜麥糠黃酮化合物的溶解性較差，解吸效果也差。當(dāng)解吸液濃度為75%時(shí)，回收率達(dá)到最高值69.87%，當(dāng)解吸液濃度在75%以上時(shí)，黃酮的溶解性變小[18]，回收率變低，洗脫效果變差。最終確定最佳乙醇濃度為75%。

圖6 乙醇濃度對(duì)大孔樹脂解吸效果的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration on desorption effect of macroporous resin

2.2.5 解吸液體積對(duì)大孔樹脂解吸效果的影響

用濃度為75%的C2H5OH溶液對(duì)HPD950樹脂解吸，并分步收集解吸液，共20管，每10 mL為一管，分別檢測(cè)各管中黃酮濃度，繪制洗脫曲線，見圖7。

圖7 HPD950大孔樹脂洗脫藜麥糠黃酮曲線Fig.7 The elution curve of quinoa chaff flavonoids by HPD950 macroporous resin

由圖7可知，管數(shù)小于7時(shí)，解吸液的黃酮濃度隨著管數(shù)的增加緩慢增加。當(dāng)收集到10管時(shí)，黃酮濃度最大，為0.427 mg/mL，此后，隨著管數(shù)的增加，黃酮濃度反而降低，黃酮類化合物主要集中在7～13管。當(dāng)管數(shù)為18管時(shí)，洗脫液內(nèi)已基本檢測(cè)不到黃酮類化合物，表明洗脫體積達(dá)到180 mL時(shí)吸附柱中黃酮基本解吸完畢。所以，最佳解吸液體積為180 mL。

2.3 藜麥糠黃酮分離純化前后純度的測(cè)定

藜麥糠黃酮經(jīng)HPD950樹脂充分地吸附和解吸后，測(cè)得回收率為77.4%，純度由純化前的13.0%上升到純化后的68.0%。結(jié)果表明HPD950樹脂對(duì)藜麥糠黃酮粗提液具有較好的分離純化效果。

2.4 藜麥糠黃酮化合物定性分析

由圖8中(B)可知，分離純化的藜麥糠黃酮樣品由9種成分組成，對(duì)照?qǐng)D8中(A)黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖，藜麥糠黃酮化合物中槲皮素、槲皮苷、蘆丁和異槲皮素4種成分得到確認(rèn)。保留時(shí)間為27.908 min的色譜峰為蘆丁；保留時(shí)間為29.223 min的色譜峰為異槲皮素，保留時(shí)間為34.553 min的色譜峰為槲皮苷，保留時(shí)間為41.669 min的色譜峰為槲皮素；色譜峰中蘆丁、槲皮苷和異槲皮素含量接近。樣品中其他保留時(shí)間的色譜峰還沒有確認(rèn)。黃酮樣品的HPLC色譜圖中色譜峰較多，其保留時(shí)間比較接近，通過洗脫條件的優(yōu)化將其基本分開，其中有些組分沒有完全基線分離，不排除有成分包含在已知峰中的可能。其他組分推測(cè)可能是蘆丁的衍生甙類[19]，單純使用HPLC進(jìn)行定性分析仍有一定的局限性，很難得知全部的黃酮化合物種類信息[20]，更精確的化合物鑒定需要借助質(zhì)譜、核磁共振等其他分析手段。

圖8 黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品(A)和純化的藜麥糠黃酮化合物(B)的HPLC色譜圖Fig.8 High performance liquid chromatograms of standard samples of flavonoids (A) and purified quinoa chaff flavonoids (B)

3 結(jié)論

在食品保鮮、抑菌、藥物、化妝品領(lǐng)域黃酮類化合物應(yīng)用廣泛，為了更好地利用藜麥糠中的黃酮類化合物，本實(shí)驗(yàn)以藜麥糠黃酮粗提物為研究對(duì)象，通過比較 D101、HPD450、HPD750、HPD950、NKA-9、X-5、AB-8 7種大孔吸附樹脂對(duì)藜麥糠黃酮的靜態(tài)吸附和解吸附實(shí)驗(yàn)，篩選出最優(yōu)樹脂，結(jié)果表明，HPD950樹脂的吸附和解吸性能均較好。利用HPD950大孔樹脂對(duì)藜麥糠黃酮粗提液的分離純化最佳工藝進(jìn)行優(yōu)化，以樣液濃度、上樣體積、上樣液pH、乙醇濃度、解吸液體積為參考因素，確定其最佳分離純化條件為：樣液濃度0.5 mg/mL，上樣體積35 mL，上樣液pH 6.0，乙醇濃度75%，解吸液體積180 mL。在此條件下分離純化后，藜麥糠中黃酮純度由(13.0±0.30)%上升到(68.0±0.50)%，回收率為(77.4±0.27)%。對(duì)純化后的藜麥糠黃酮類化合物進(jìn)行高效液相色譜定性分析，樣品中槲皮素、槲皮苷、異槲皮素、蘆丁4種成分得到確認(rèn)。本實(shí)驗(yàn)為藜麥糠天然黃酮類化合物的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。