馬艷莉，梁靜靜，李大偉，丁玉峰，李素萍，席曉麗，王頡，郭書賢

(1.南陽(yáng)理工學(xué)院 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473004；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000)

腐乳，類似于西方奶酪，是豆腐經(jīng)霉菌或細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵成毛坯，然后將毛坯用鹽腌制，最后將鹽坯在加有香辛料、酒類等混合輔料中成熟3個(gè)月左右[1,2]。腐乳是在開放式環(huán)境下制作而成，生產(chǎn)過(guò)程中所涉及的自然發(fā)酵過(guò)程易受環(huán)境中微生物的污染，且腐乳中含有豐富的氨基酸，含氮類化合物的不完全代謝會(huì)產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，如生物胺、氨基甲酸乙酯等[3]。

生物胺是一種有機(jī)含氮低分子化合物，主要由氨基酸的脫羧或醛酮的胺化和轉(zhuǎn)氨作用形成，主要包括色胺、組胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺和亞精胺[4]。攝入一定的生物胺，對(duì)人體健康有危害，食品和藥物管理局規(guī)定組胺在金槍魚等相關(guān)魚類中的限量值為50 mg/kg, 且總生物胺含量在500～1000 mg/kg會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在危害[5]。關(guān)于腐乳中生物胺的研究，大多數(shù)研究者集中在腐乳中生物胺分布的調(diào)查、接種不同毛霉對(duì)生物胺產(chǎn)生的影響、后發(fā)酵輔料對(duì)生物胺產(chǎn)生的影響等。例如，Kung等[6]對(duì)市售的32個(gè)腐乳樣品中的生物胺進(jìn)行了檢測(cè)，共檢測(cè)到8種生物胺，其中白方和紅方腐乳中組胺平均含量低于50 mg/kg，只有1個(gè)紅方腐乳樣品中組胺含量高達(dá)158 mg/kg，具有安全隱患。對(duì)于儲(chǔ)藏條件對(duì)腐乳生物胺的研究鮮有報(bào)道。

腐乳作為美味可口的佐餐小菜和烹飪中的調(diào)味料，通常人們開瓶后不會(huì)一次性食用完，而是放置于冰箱或室溫保存。本研究旨在探討不同儲(chǔ)藏溫度和儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)開蓋紅方腐乳的生物胺含量和理化性質(zhì)變化的影響，旨在為消費(fèi)者提供合理的儲(chǔ)藏方式和食用建議。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅方腐乳：購(gòu)自河北省保定市當(dāng)?shù)爻校簧V乙腈：購(gòu)自上海Merck試劑有限公司；丹磺酰氯(HPLC，≥98%)：購(gòu)自上海麥克林試劑有限公司；濃鹽酸(37%)、氨水、乙酸銨、丙酮、無(wú)水乙酸鈉、三乙胺、氫氧化鈉、碳酸氫鈉：購(gòu)自天津市天力化學(xué)試劑有限公司；純凈水：購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀 美國(guó)Waters儀器有限公司；液相色譜柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm) 美國(guó)Agilent儀器有限公司；XHF-DY攪拌分離器 上海奧克斯儀器有限公司；5424R高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；SPX生化培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司；QL-861渦旋機(jī) 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Novasina CH-8533水分活度儀 瑞士AG公司。

1.3 不同溫度下開蓋紅方腐乳儲(chǔ)藏試驗(yàn)

8瓶紅方腐乳購(gòu)自河北省保定市當(dāng)?shù)爻?，開蓋后在不同溫度(4，15，25，35 ℃)下各放置兩瓶，分別于儲(chǔ)藏1，15，30，45，60 d取樣測(cè)定。

1.4 生物胺含量測(cè)定

樣品的前處理及生物胺的衍生參考李大偉等的方法[7]。

1.5 理化指標(biāo)測(cè)定方法

水分活度的測(cè)定：使用水分活度測(cè)定儀測(cè)定，操作如下：在溫度18～25 ℃、濕度50%～80%的條件下，首先用飽和的鹽溶液校正儀器，準(zhǔn)確稱取約1 g(精確至0.01 g)樣品，放入樣品皿中，再封閉測(cè)量倉(cāng)，然后測(cè)定讀數(shù)。5 min后記錄儀器的響應(yīng)值。同一樣品重復(fù)測(cè)定3次。

pH的測(cè)定：參照劉振鋒的方法[8]。取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL去離子水后用攪拌分離器均質(zhì)，然后在4 ℃下3600×g離心25 min，取上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，用pH計(jì)測(cè)定，同一樣品重復(fù)測(cè)定3次。

氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：參照SB/T 10170-2007的方法[9]。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，顯著水平為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅方腐乳開蓋貯藏過(guò)程中生物胺含量的變化

在不同溫度下，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，開蓋紅方腐乳中8種生物胺的含量變化見(jiàn)表1。

表1 紅方腐乳開蓋貯藏過(guò)程中生物胺含量的變化Table 1 Changes of biogenic amines content in lid-opened red sufu during storage mg/kg

續(xù) 表

在4 ℃儲(chǔ)藏下，總生物胺呈先升高再降低的趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)最高的生物胺含量(876.20 mg/kg)在儲(chǔ)藏第15天的樣品中檢測(cè)到，是未經(jīng)儲(chǔ)藏樣品總胺含量的10倍左右。對(duì)于每種胺，均在樣品儲(chǔ)藏第15天檢測(cè)到最高值，為色胺(132.94 mg/kg)、苯乙胺(79.47 mg/kg)、腐胺(76.50 mg/kg)、尸胺(51.65 mg/kg)、組胺(280.21 mg/kg)、酪胺(45.24 mg/kg)、亞精胺(180.94 mg/kg)、精胺(29.26 mg/kg)，由此可知，儲(chǔ)藏第15天的樣品中主要的生物胺是色胺、組胺、亞精胺，分別占總生物胺的15.17%、31.98%和20.65%。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，色胺、苯乙胺、酪胺、精胺均呈現(xiàn)先增加到最高值后呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)，特別是精胺在儲(chǔ)藏第45天時(shí)幾乎檢測(cè)不到；腐胺、組胺、尸胺、亞精胺除了在第15天達(dá)到最高值，在第45天也會(huì)以高含量出現(xiàn)，所以在第45天高含量的生物胺是腐胺、組胺、尸胺、亞精胺的增加所導(dǎo)致的。

在15 ℃儲(chǔ)藏下，儲(chǔ)藏第15天的總生物胺含量與第60天的生物胺含量無(wú)顯著差異，不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)總生物胺含量高低排序?yàn)椋旱?0天>第15天>第45天>第30天>第0天。每種胺的變化趨勢(shì)也不一致，大多呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，且在儲(chǔ)藏第15天檢測(cè)到腐胺和組胺的最高值，在儲(chǔ)藏第30天檢測(cè)到色胺、苯乙胺和精胺的最高值，在儲(chǔ)藏第60天檢測(cè)到尸胺和亞精胺的最高值。值得注意的是，亞精胺在儲(chǔ)藏第60天才檢測(cè)到，且以高濃度出現(xiàn)，儲(chǔ)藏最后出現(xiàn)的最高的生物胺總量(555.49 mg/kg)是由亞精胺的增加(0～153.77 mg/kg)引起的。而儲(chǔ)藏第15天時(shí)較高的生物胺總量是由于組胺的驟然增加引起的，從28.37 mg/kg增加至290.02 mg/kg。

在25 ℃儲(chǔ)藏下，總生物胺在儲(chǔ)藏第15天檢測(cè)到最高含量(596.63 mg/kg)，其中組胺占總生物胺的57.55%，為主要的生物胺。亞精胺在整個(gè)儲(chǔ)藏過(guò)程都沒(méi)有檢測(cè)到，精胺只在儲(chǔ)藏第15天和第30天檢測(cè)到。除了尸胺和酪胺，所有生物胺的最高值在儲(chǔ)藏第15天檢測(cè)到，且大多生物胺的變化呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)。

在35 ℃儲(chǔ)藏下，總生物胺含量也是呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，也在儲(chǔ)藏第15天出現(xiàn)了最高值(643.16 mg/kg)，其中組胺占總生物胺的53.03%。大多數(shù)胺包括色胺、苯乙胺、腐胺和組胺在儲(chǔ)藏第15天出現(xiàn)最高值，酪胺在第30天出現(xiàn)最高值，這幾種胺的變化與在25 ℃儲(chǔ)藏下的變化趨勢(shì)相同。

綜合比較不同溫度下儲(chǔ)藏生物胺的變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)不論在哪個(gè)溫度下儲(chǔ)藏，較高的總生物胺量均在第15天可以檢測(cè)到；亞精胺隨著溫度的升高，含量減少至幾乎檢測(cè)不到；作為最主要和毒性最大的胺——組胺，在高溫下更容易生成組胺。Ordonez等[10]研究了儲(chǔ)存條件對(duì)開瓶葡萄酒中生物胺的影響，發(fā)現(xiàn)在不同儲(chǔ)存條件檢測(cè)到某些生物胺的濃度略有變化。Ngapo等[11]對(duì)加拿大豬肉在不同溫度貯藏過(guò)程中生物胺的含量和變化過(guò)程進(jìn)行研究，宰后48 h腰部位的豬肉分別在-1.7 ℃冷藏(分別于13，28，43，58 d取樣)和4 ℃貯藏5 d，腐胺、精胺和亞精胺含量隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；尸胺被檢測(cè)出不受冷藏條件的影響，僅在-1.7 ℃貯藏至43 d后在部分樣品中檢測(cè)到。在整個(gè)貯藏過(guò)程中生物胺的濃度不高，不會(huì)造成中毒風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 紅方腐乳開蓋貯藏過(guò)程中理化性質(zhì)的變化

生物胺的生成與水分活度有密切的關(guān)聯(lián)，水分活度通過(guò)影響微生物的生長(zhǎng)代謝和微生物分泌的氨基酸脫羧酶活性間接影響生物胺合成。在不同溫度下，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，開蓋紅方腐乳水分活度的變化見(jiàn)圖1。

圖1 紅方腐乳開蓋貯藏過(guò)程中水分活度(Aw)的變化Fig.1 The change of water activity of lid-opened red sufu during storage

由圖1可知，在25 ℃和35 ℃貯藏的紅方腐乳，Aw的變化都呈先下降后上升的趨勢(shì)，而在4 ℃和15 ℃貯藏的腐乳Aw變化規(guī)律與25 ℃和35 ℃相反，呈先上升后下降的趨勢(shì)。所有樣品的水分活度均大于0.85，為各種微生物的生長(zhǎng)和酶的分泌提供了很好的水環(huán)境。

pH值主要是通過(guò)影響微生物的生長(zhǎng)代謝和微生物分泌的氨基酸脫羧酶活性來(lái)影響生物胺的生成，其生成也被認(rèn)為是微生物抵抗酸性環(huán)境的作用。Bubelova等[12]研究了不同pH(4，5，6，7，8)對(duì)沙雷氏菌CCM 303生長(zhǎng)、腐胺和尸胺含量的綜合影響，結(jié)果表明在pH 5～7的培養(yǎng)條件下，腐胺和尸胺濃度最高。Greif等[13]研究了NaCl濃度和初始pH值對(duì)GTY發(fā)酵液中產(chǎn)氣腸桿菌和陰溝腸桿菌生成生物胺的影響。在含3% NaCl的肉湯中，尸胺和組胺濃度最高。在NaCl濃度為0.5%、pH值為6時(shí)，腐胺含量最高。在不同溫度下，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，開蓋紅方腐乳pH值的變化見(jiàn)圖2。

圖2 紅方腐乳開蓋貯藏過(guò)程中pH值的變化Fig.2 The change of pH values of lid-opened red sufu during storage

由圖2可知，在4 ℃儲(chǔ)藏下的pH值偏高，在15 ℃和25 ℃儲(chǔ)藏下的pH值偏低，且從第0～45 d，pH值呈波動(dòng)變化，45 d以后，所有溫度下的pH都大幅度下降，除了在15 ℃下儲(chǔ)藏的樣品。

氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸狀態(tài)存在的氮元素，發(fā)酵產(chǎn)品中通過(guò)測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量來(lái)了解氮源的量及被微生物利用的情況[14]。不同溫度下，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，開蓋紅方腐乳氨基酸態(tài)氮含量的變化見(jiàn)圖3。

圖3 紅方腐乳開蓋貯藏過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.3 The change of amino acid nitrogen content of lid-opened red sufu during storage

紅方腐乳在整個(gè)貯藏過(guò)程中，除25 ℃貯藏的腐乳外，其他3種貯藏溫度下的腐乳FAAN含量有相同的變化規(guī)律。在15 ℃貯藏的紅方腐乳在整個(gè)貯藏過(guò)程中FAAN含量變化不大，4 ℃貯藏的紅方腐乳在第60天時(shí)FAAN達(dá)到最大值(0.42 g/100 g)，通過(guò)分析可得，F(xiàn)AAN和生物胺之間存在著一定的關(guān)系，在貯藏過(guò)程中FAAN含量的變化一定程度上也反映出總胺含量的動(dòng)態(tài)變化，之前也有研究者表明氨基酸態(tài)氮與生物胺存在正相關(guān)[15]。

2.3 主成分分析

為了更直觀地反映不同溫度下儲(chǔ)藏的樣品與各種生物胺之間的關(guān)聯(lián)，使用主成分分析法對(duì)8種生物胺進(jìn)行主成分加權(quán)，由圖4可知，前2個(gè)主成分解釋了累計(jì)方差貢獻(xiàn)率的98.1%，可以說(shuō)明樣品的大部分信息。其中除了組胺以外的7種胺均在主成分1的正半軸，其中酪胺和尸胺分布在主成分2的負(fù)半軸，其余的胺分布在主成分2的正半軸。

圖4 主成分分析載荷圖Fig.4 Load diagram of principal component analysis

圖5 主成分分析的因子得分圖Fig.5 Factor scoring chart of principal component analysis

由圖5可知，在4 ℃下，更有利于促進(jìn)亞精胺的生成；25 ℃和35 ℃儲(chǔ)藏下的樣品分布在組胺的象限中，說(shuō)明在此溫度下，可以促進(jìn)組胺的合成；25 ℃和35 ℃儲(chǔ)藏下的樣品聚集在一起，說(shuō)明在儲(chǔ)藏過(guò)程中，這兩個(gè)溫度下的樣品中生物胺的變化類似；隨著儲(chǔ)藏溫度的升高，樣品從主成分1的正半軸轉(zhuǎn)向負(fù)半軸，更易受組胺含量的影響。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)紅方腐乳開蓋后在不同溫度條件下貯藏對(duì)生物胺影響的研究，初步明確了貯藏溫度對(duì)紅方腐乳開蓋后生物胺的影響。腐乳在剛開蓋時(shí)苯乙胺含量低于30 mg/kg，組胺含量低于100 mg/kg，酪胺低于100 mg/kg。在4種溫度貯藏至第15天，苯乙胺和組胺含量分別超過(guò)30 mg/kg和100 mg/kg。在25 ℃和35 ℃貯藏的腐乳，前期(0～15 d)苯乙胺和組胺含量均顯著高于其他兩種貯藏溫度下的腐乳。在35 ℃條件下貯藏的腐乳酪胺含量顯著高于其他3個(gè)貯藏溫度的腐乳，且在整個(gè)貯藏過(guò)程中酪胺含量均在100 mg/kg以下。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，腐乳開蓋后即使在4 ℃貯藏，在第15天也可能出現(xiàn)組胺和苯乙胺中毒情況，綜上所述，為了保證食用安全性，紅方腐乳開蓋后盡量在15 d內(nèi)食用完。