于學娟，姜竹茂，陳英鄉(xiāng)

(1.煙臺職業(yè)學院，山東 煙臺 264000；2.煙臺大學，山東 煙臺 264005)

金槍魚是一類具有胸甲的幾個屬魚類的總稱，是世界上主要的魚類資源之一[1]。金槍魚富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、氨基酸和微量元素，具有很高的保健價值，并可促進腦的發(fā)育，改善記憶力，預防老年癡呆和“三高癥”，同時還兼具瘦身美容的功能等[2]。因此，金槍魚作為營養(yǎng)與健康并存的食物，被加工成各類食品，但在其加工中產(chǎn)生約50%～70%的副產(chǎn)物，金槍魚副產(chǎn)物中只有少部分被加工成魚粉等作為飼料出售，絕大多數(shù)副產(chǎn)物未被充分開發(fā)利用，造成資源浪費，因此迫切需要開拓金槍魚副產(chǎn)物的增值途徑。

水產(chǎn)加工副產(chǎn)物因營養(yǎng)豐富，活性肽類產(chǎn)品制備成為其高值化利用的熱點研究。目前，研究人員主要采用酶解工藝對其進行研究開發(fā)，探索了活性肽和基于酶解的調(diào)味料的生產(chǎn)工藝[3-11]。此方法雖工藝流程簡單、容易操作，但酶對水產(chǎn)品蛋白質(zhì)的降解無法消除其固有的腥味，并且酶解產(chǎn)物易被污染，導致變質(zhì)，難于儲藏。因而，近年來利用發(fā)酵法研究水產(chǎn)加工副產(chǎn)物的高值化應用得到人們的關注。發(fā)酵法利用微生物與水產(chǎn)下腳料進行固態(tài)發(fā)酵，可生成具有抗菌、保健等多種功能的活性肽[12-14]。如果能與蛋白肽的液態(tài)制備工藝有效融合，不僅可分解水產(chǎn)加工副產(chǎn)物制備基于蛋白肽類的無腥味調(diào)味料，同時還可賦予發(fā)酵產(chǎn)物抑菌功能，從而獲得延長食品貨架期的天然調(diào)味料。然而，利用微生物開展金槍魚下腳料發(fā)酵工藝及防腐功能海鮮風味調(diào)料的研究鮮見報道。

本試驗使用金槍魚下腳料為基質(zhì)，以水解度為指標，采用納豆菌和枯草芽孢桿菌進行雙菌液態(tài)發(fā)酵，通過考察單因素試驗和響應面(RSM)[15-17]Box-Behnken設計(BBD)對雙菌納豆菌(Bacillusnatto)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)發(fā)酵條件進行優(yōu)化和相關分析，從而確定發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)。利用最佳發(fā)酵工藝制備的發(fā)酵液生產(chǎn)防腐功能海鮮風味調(diào)料，為金槍魚下腳料的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚下腳料：去除內(nèi)臟和魚皮，清洗并絞碎備用，山東藍潤水產(chǎn)有限公司；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、納豆菌(Bacillusnatto)：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院；乙腈(色譜純)：美國Fisher Scientific公司；試驗用水均為重蒸水；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TSQ Quantum Access HPLC/MS聯(lián)用儀 美國Thermo公司；HZQ-F160型恒溫搖床 金壇市萬華實驗儀器廠；QB立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海云泰儀器儀表有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；UV-2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；GB1302電子精密天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；F1-130藥物粉碎機 中南制藥機械有限公司；TL-250 低速大容量離心機 威海海拓儀器設備有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀(AAA) 日本Hitachi公司；RE-52CS-1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Milli-Q Academic 超純水系統(tǒng) 美國默克密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及生產(chǎn)菌液制備

1.3.1.1 納豆菌活化及生產(chǎn)菌液制備

取甘油封存的納豆芽孢桿菌菌種，采用平板劃線法接種到BPY培養(yǎng)基上，在37 ℃進行24 h倒置培養(yǎng)；再將其接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，靜置培養(yǎng)，24 h活化完成；將活化后的納豆菌接種于液體培養(yǎng)基中，在溫度為37 ℃、搖床頻率為120 r/min下培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液的OD630至1.2～2.0即得到生產(chǎn)菌液。

1.3.1.2 枯草芽孢桿菌活化及生產(chǎn)菌液制備

取枯草芽孢桿菌凍干粉，將其溶于營養(yǎng)瓊脂/肉汁培養(yǎng)基，采用涂布法接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，在37 ℃進行24 h倒置培養(yǎng)即得活化的枯草芽孢桿菌；將活化后的菌接種于液體培養(yǎng)基中，在溫度為37 ℃、搖床頻率為150 r/min下培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液的OD630至1.5～2.5即得到生產(chǎn)菌液。

1.3.2 雙菌發(fā)酵工藝研究與響應面試驗設計

1.3.2.1 雙菌發(fā)酵制備防腐功能海鮮風味調(diào)料的工藝流程

將金槍魚下腳料、麩皮和葡萄糖按15∶4∶1混勻作為發(fā)酵基質(zhì)，裝入1 L錐形瓶中，加入一定量水(含水量90%～100%)，在溫度為121 ℃下滅菌20 min，待冷卻至30 ℃，接入納豆菌和枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌液，然后置于40 ℃生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵，并每隔4 h攪拌一次，72 h后發(fā)酵完成；發(fā)酵終產(chǎn)物經(jīng)過濾，獲得防腐功能海鮮風味調(diào)料。

1.3.2.2 單因素試驗

稱取500 g發(fā)酵基質(zhì)，為系統(tǒng)全面地研究雙菌發(fā)酵制備防腐功能海鮮風味調(diào)料工藝，本試驗對主要影響變量進行了分析，選取基質(zhì)水分含量(≤50%、50%～70%、70%～90%、90%～100%、100%～120%、120%～140%、140%～160%)、初始pH值(5.5，6，6.5，7，7.5，8,8.5)、接種量(2，5，8，11，14，17，20 mL/100 g)、雙菌接種量比(14∶0、12∶2、10∶4、8∶6、7∶7、4∶10、2∶12)、發(fā)酵溫度(25，30，35，40，45，50，55 ℃)和發(fā)酵時間(36，48，60，72，84，96，108 h)6個變量分別進行單因素試驗，研究各因素對防腐功能海鮮風味調(diào)料發(fā)酵中水解度的影響。

1.3.2.3 響應面試驗設計

為系統(tǒng)研究雙菌發(fā)酵制備防腐功能海鮮風味調(diào)料的工藝中各因素對其的影響，以單因素試驗條件為基礎設計響應面試驗，最終選取基質(zhì)水分含量、雙菌接種量比、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度4個因素，設計四因素三水平的BBD試驗，試驗結果以水解度為指標，響應面試驗設計的因素與水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素與編碼水平Table 1 Factors and coded levels of RSM design

2 結果與分析

2.1 雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料工藝單因素試驗結果與分析

2.1.1 基質(zhì)水分含量對雙菌發(fā)酵的影響

在初始pH 7.5、接種量14 mL/100 g、雙菌接種量比7∶7和發(fā)酵溫度40 ℃的條件下，發(fā)酵基質(zhì)水分含量分別在≤50%、50%～70%、70%～90%、90%～100%、100%～120%、120%～140%、140%～160%時進行雙菌發(fā)酵72 h，研究基質(zhì)水分含量對雙菌發(fā)酵的影響，結果見圖1。

圖1 基質(zhì)水分含量對雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料水解度的影響Fig.1 Effect of substrate water content on the hydrolysis degree of tuna scraps by double bacteria fermentation

由圖1可知，隨著基質(zhì)水分含量的不斷提高，金槍魚下腳料的水解度呈現(xiàn)先增后降的變化趨勢，并在基質(zhì)水分含量為90%～100%時，雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料達到最高水解度(43.61%)。結果表明，金槍魚下腳料雙菌發(fā)酵的水解度與初始基質(zhì)水分含量直接相關，根據(jù)微生物生理特性，水分是微生物生長和代謝的決定因素，基質(zhì)水分含量低，不利于雙菌的生長，導致次級代謝生成的酶量及其活性不足；而基質(zhì)水分含量過高，阻礙了氧氣的傳遞，抑制了雙菌的呼吸生長，限制了雙菌的活性和降低了酶的生成量，因此過低或過高的基質(zhì)水分含量都會降低雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料的水解度。經(jīng)SPSS分析，基質(zhì)水分含量為90%～100%時金槍魚下腳料的水解度顯著大于其余基質(zhì)水分含量(P<0.05)，故最佳基質(zhì)水分含量選擇90%～100%。

2.1.2 初始pH值對雙菌發(fā)酵的影響

在基質(zhì)水分含量90%～100%、接種量14 mL/100 g、雙菌接種量比7∶7和發(fā)酵溫度40 ℃的條件下，發(fā)酵基質(zhì)初始pH值分別在5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5時進行雙菌發(fā)酵72 h，研究基質(zhì)初始pH值對雙菌發(fā)酵的影響，結果見圖2。

圖2 初始pH值對雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料水解度的影響Fig.2 Effect of initial pH value on the hydrolysis degree of tuna scraps by double bacteria fermentation

由圖2可知，在pH 5.5～7.5范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料的水解度急劇增高，pH 7.5時水解度達到最大值44.72 %，而在pH大于7.5時，水解度隨著pH的增大而快速下降。結果表明，pH值過高或過低均不利于雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料的水解，這是由于雙菌活性受pH的影響，其活性的變化導致分泌酶的能力出現(xiàn)波動，且酶的活性也受pH的影響，在小于或大于最適 pH時酶活降低，因此雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料的水解度均表現(xiàn)出顯著下降(P<0.05)，故選擇最佳初始pH值為7.5。

2.1.3 接種量對雙菌發(fā)酵的影響

在基質(zhì)水分含量90%～100%、初始pH 7.5、雙菌接種量比7∶7和發(fā)酵溫度40 ℃的條件下，發(fā)酵基質(zhì)雙菌接種量分別為2，5，8，11，14，17，20 mL/100 g時進行雙菌發(fā)酵72 h，研究接種量對雙菌發(fā)酵的影響，見圖3。

圖3 接種量對雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料水解度的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on the hydrolysis degree of tuna scraps by double bacteria fermentation

由圖3可知，隨著雙菌接種量的增加，金槍魚下腳料的水解度隨之增加，當雙菌接種量為14 mL/100 g時水解度達到42.17%，之后雙菌接種量再增加，水解度的增量均表現(xiàn)為非顯著上升(P>0.05)。這可能是由于菌種濃度的增加，引起微生物的競爭性抑制，最終影響了雙菌分泌酶量的減少。考慮到經(jīng)濟效益，選擇最佳接種量為14 mL/100 g。

2.1.4 雙菌接種量比對雙菌發(fā)酵的影響

在基質(zhì)水分含量90%～100%、初始pH 7.5、接種量14 mL/100 g和發(fā)酵溫度40 ℃的條件下，發(fā)酵基質(zhì)雙菌接種量比分別為14∶0、12∶2、10∶4、8∶6、7∶7、4∶10、2∶12時進行雙菌發(fā)酵72 h，研究雙菌接種量比對雙菌發(fā)酵的影響，結果見圖4。

圖4 雙菌接種量比對雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料水解度的影響Fig.4 Effect of inoculation amount ratio on the hydrolysis degree of tuna scraps by double bacteria fermentation

由圖4可知，隨著枯草芽孢桿菌比例的增加，金槍魚下腳料的水解度先略有增加隨后急劇提高，當雙菌接種量比為7∶7時，水解度趨向于最佳值41.99%，與其相比，之后水解度的增加量均呈非顯著增加(P>0.05)?？赡苁怯捎诩{豆菌分解蛋白質(zhì)活性低于枯草芽孢桿菌，但納豆菌比例降低至一定量時，其生物功能趨于穩(wěn)定，枯草芽孢桿菌增加到一定量時，其對蛋白質(zhì)的生物學活性無顯著差異(P>0.05)。考慮到經(jīng)濟性，選擇最佳雙菌接種量比為7∶7。

2.1.5 發(fā)酵溫度對雙菌發(fā)酵的影響

在基質(zhì)水分含量90%～100%、初始pH 7.5、接種量14 mL/100 g和雙菌接種量比7∶7的條件下，設置發(fā)酵溫度分別為25，30，35，40，45，50，55 ℃，雙菌發(fā)酵72 h，研究發(fā)酵溫度對雙菌發(fā)酵的影響，結果見圖5。

由圖5可知，在25～40 ℃范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度的升高，金槍魚下腳料的水解度不斷增加，且增加幅度逐漸提高，在40 ℃時水解度達到峰值43.55%，隨后繼續(xù)升高溫度，水解度快速下降。結果表明，溫度是影響雙菌發(fā)酵的重要因素之一，在適宜的溫度條件下，菌株生長與代謝旺盛，產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物和酶數(shù)量多且活性高，反之，菌株的活性降低，導致分泌的酶量不足，難以發(fā)揮蛋白質(zhì)的降解作用，故選擇最佳發(fā)酵溫度為40 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料水解度的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the hydrolysis degree of tuna scraps by double bacteria fermentation

2.1.6 發(fā)酵時間對雙菌發(fā)酵的影響

在基質(zhì)水分含量90%～100%、初始pH 7.5、接種量14 mL/100 g、雙菌接種量比7∶7和發(fā)酵溫度40 ℃的條件下，發(fā)酵時間分別為36，48，60，72，84，96，108 h時進行雙菌發(fā)酵，研究發(fā)酵時間對雙菌發(fā)酵的影響，結果見圖6。

圖6 發(fā)酵時間對雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料水解度的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the hydrolysis degree of tuna scraps by double bacteria fermentation

由圖6可知，隨著發(fā)酵時間的延長，金槍魚下腳料的水解度升高趨勢明顯，發(fā)酵至72 h時，水解度達到42.64%，之后水解度間無顯著差異(P>0.05)。這是由于隨著發(fā)酵時間的延長，基質(zhì)中菌和酶的含量逐漸增加，基質(zhì)不斷被消耗，導致水解度先緩慢增加后急劇提高，在發(fā)酵后期，產(chǎn)物與基質(zhì)中底物產(chǎn)生競爭抑制或者產(chǎn)物占據(jù)酶催化部位導致酶失活，水解度達到平衡。考慮到經(jīng)濟性，選擇最佳發(fā)酵時間為72 h。

2.2 雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料工藝優(yōu)化結果與分析

2.2.1 RSM回歸模型及顯著性結果與分析

表2中的試驗結果采用多元回歸擬合，建立響應值(Y金槍魚下腳料的水解度)與4個因素之間的多元二次回歸模型(A雙菌接種量比；B發(fā)酵時間；C基質(zhì)水分含量；D發(fā)酵溫度)，其回歸模型方程為：Y=41.60+2.47A-1.19B+2.87C+2.12D-3.84AB-2.41AC-2.25AD+1.75BC+3.44BD-3.50CD-1.67A2-2.39B2-0.042C2-2.35D2。

表2 RSM試驗設計及結果Table 2 RSM experimental design and results

所得二次多項回歸模型方差分析結果見表3。

表3 RSM回歸模型方差分析Table 3 The analysis of variance for the fitted regression model of RSM

結果顯示：該回歸模型的P=0.0001<0.01(屬極顯著)，試驗結果和該回歸模型高度擬合，表明該回歸模型具有極高可靠性；失擬項 P=0.2655>0.05(屬不顯著)，回歸模型與試驗數(shù)據(jù)擬合充分，試驗誤差小，說明試驗結果受未知因素干擾很小，也就是說該回歸模型可用于分析和預測金槍魚下腳料雙菌發(fā)酵工藝條件，且回歸模型的R2=0.9915，RAdj2= 0.9830，C.V.=1.46%，說明金槍魚下腳料水解度的真實值與預測值的擬合度好，回歸模型能反映實際情況。另外，回歸模型中除C2(P=0.8530)不顯著，其余因素(A，B，C，D；A2、B2、D2)與因素之間(AB、AC、AD、BC、BD、CD)的P<0.01，具有極顯著影響，也表明回歸模型可以很好地描述各因素間與水解度的關系。F值顯示：4個因素對水解度的影響大小依次為C>A>D>B，即基質(zhì)水分含量>雙菌接種量比>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間。綜上，本試驗方法可靠，各因素設計合理，該回歸模型可以替代真實試驗分析和預測金槍魚下腳料雙菌發(fā)酵工藝。

2.2.2 響應面分析

響應面圖能直觀地反映每個因素對水解度的影響程度，而因素之間交互作用強弱反映水解度響應不同因素變化的敏感度。若等高線為橢圓形反映兩因素有相對較強的交互作用，而等高線為圓形則表明兩因素有相對較弱的交互作用，另外，等高線密集且間距窄表示因素影響加大，反之因素影響?。豁憫嫫露仍酱蟊砻魉舛葘ψ兞康母淖冊矫舾?，反之則越遲鈍。

由圖7可知，本試驗所選4個因素之間交互作用的響應曲面坡度均比較陡峭且彎曲度較大，反映各因素對水解度的影響極顯著；等高線顯示：沿各因素軸向等高線密集，且趨向于橢圓形，表明4個因素之間交互作用極顯著，另外從等高線密集程度與間距寬窄可得各因素影響大小為C(基質(zhì)水分含量)>A(雙菌接種量比)>D(發(fā)酵溫度)>B(發(fā)酵時間)，上述結果與表3的回歸結果分析一致。圖7的響應面均呈現(xiàn)向上凸的曲面，說明水解度存在最大值。通過回歸模型方程預測水解度的結果顯示：其極值點為A=7∶7，B=72，C=100%，D=40，此時預測的水解度最大值為48.7683%。

圖7 各因素交互作用對金槍魚下腳料水解度的響應面圖和等高線Fig.7 The response surface diagrams and contour lines of the interaction of various factors on hydrolysis degree of tuna scraps

2.2.3 雙菌發(fā)酵最佳優(yōu)化工藝及驗證試驗

為確定預測值的可靠性與準確性，依據(jù)回歸模型優(yōu)化金槍魚下腳料雙菌發(fā)酵的最佳條件，并結合實際生產(chǎn)操作的可行性，最佳工藝參數(shù)設定為：基質(zhì)水分含量90%～100%，接種量14 mL/100 g，雙菌接種量比7∶7，發(fā)酵溫度40 ℃，發(fā)酵時間72 h，初始pH 7.5。以此條件進行3次重復試驗，結果見表4。

表4 雙菌發(fā)酵最佳參數(shù)及驗證試驗結果Table 4 The optimum parameters of double bacteria fermentation and the results of verification test

由表4可知，水解度的測定值(48.2912%)與預測值(48.7683%)的誤差為0.98%，未表現(xiàn)出顯著差異性，說明該RSM模型能替代試驗預測雙菌發(fā)酵的實際情況。

3 結論

以單因素試驗為基礎，確定發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、雙菌接種量比和基質(zhì)水分含量進行響應面試驗設計，優(yōu)化金槍魚下腳料雙菌發(fā)酵制備調(diào)味料的工藝，BBD模型擬合與方差分析結果表明：所建回歸模型效果極顯著，4個因素及兩因素之間的交互作用對水解度的影響極顯著，各因素的影響大小順序是基質(zhì)水分含量(C)>雙菌接種量比(A)>發(fā)酵溫度(D)>發(fā)酵時間(B)；優(yōu)化所得最佳工藝參數(shù)為基質(zhì)水分含量90%～100%，接種量14 mL/100 g，雙菌接種量比7∶7，發(fā)酵溫度40 ℃，發(fā)酵時間72 h，初始pH值7.5。水解度與預測值無顯著性差異，表明RSM模型可替代試驗預測雙菌發(fā)酵制備調(diào)味料的實際情況。