周曉艷，李 越，何 謙，袁曉紅，張海寶

（1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710004； 2.西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710061）

抗增殖蛋白（Prohibitin，phb/PHB)，是一種高度保守的蛋白質(zhì)，因具有增殖抑制作用而得名，分PHB1 和PHB2 兩個(gè)亞型[1]。在自然界中分布廣泛，參與人類腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)錄、分化、凋亡及能量代謝等過程，與細(xì)胞衰老、免疫調(diào)節(jié)、代謝性及炎癥性疾病亦緊密聯(lián)系。在細(xì)胞內(nèi)作為重要的分子伴侶參與線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性[2]。近年來乳腺癌發(fā)病率及死亡率逐年升高，而 PHB 在乳腺癌組織中表達(dá)升高[3]，提示可能成為乳腺癌早期篩查新的生物標(biāo)志物，可作為乳腺癌診療的重要靶點(diǎn)[4,5]。本課題組在前期蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，核基質(zhì)蛋白PHB 在正常乳腺組織、乳腺增生性病變組織、不典型上皮增生組織和乳腺癌組織4 個(gè)乳腺癌不同階段表達(dá)逐漸升高[6]，并鑒定了PHB 干擾在乳腺癌MCF-7 中低表達(dá)的效果[7]。此次研究驗(yàn)證了PHB 的高表達(dá)，以及PHB 在乳腺癌細(xì)胞MCF-7 的生物學(xué)功能及生長抑制機(jī)制，為乳腺癌的臨床診斷、治療和藥物研發(fā)提供新靶標(biāo)和新的研究線索。

1 材料與試劑

1.1 細(xì)胞株來源 人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞保留了多個(gè)分化了的乳腺上皮特性，該研究中MCF-7 受贈(zèng)與西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑 胎牛血清和DMEM 高糖培養(yǎng)基購于HyClone 公 司，LipofectamineTM2000 為Invitrogen 公司產(chǎn)品，擴(kuò)增試劑為青島Takara 公司產(chǎn)品，Anti-prohibitin 抗體（ab47778）和兔抗人β-actin（ab6276）均為英國Abcam 公司購買，周期及凋亡試劑盒購于武漢凱基生物有限公司，BALB/C 裸鼠來自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 pEGFP-PHB 基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建：在NCBI 中查閱PHB 的基因序列，以NM_002634 為模板，根據(jù)全基因序列，設(shè)計(jì)29 條引物依次進(jìn)行擴(kuò)增，使其序列不斷延長，直至完成所需序列。擴(kuò)增后電泳，回收837kb 左右條帶進(jìn)行基因測序。使用Bgl Ⅱ/BamH I 內(nèi)切酶回收所需的載體骨架pEGFP-C1。將PCR 擴(kuò)增得到的全長基因和載體在同源重組酶下重組。選用標(biāo)準(zhǔn)大腸菌株ATCC 25922 為轉(zhuǎn)化菌株，轉(zhuǎn)化并挑取單克隆進(jìn)行基因測序。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10ml/dl 胎牛血清的DMEM（高糖）培養(yǎng)液于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5ml/dl CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2天換液一次，3 天傳代一次。轉(zhuǎn)染時(shí)DNA 與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 最佳比例為1∶3。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-PHB 組為PHB 高表達(dá)組，即OE 組（轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-PHB），轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組為陰性對照組，即NC 組（轉(zhuǎn)染載體pEGFP），只添加Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑定位空白對照組，即MOCK 組（只添加轉(zhuǎn)染試劑）。轉(zhuǎn)染于6, 12, 24, 48 和72h 細(xì)胞的生長狀態(tài)及熒光表達(dá)情況。

1.3.3 real Time PCR 檢測PHB 基因表達(dá)：使用Trizol試劑提取總RNA，每組細(xì)胞重復(fù)3 次，分別提取總RNA，使用Nanodrop2000 核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度并做RNA 變性實(shí)驗(yàn)。使用Primer 3.0 軟件設(shè)計(jì)引物（PHB: Primer1: 5'-GGCTGAGCAACAGAAAAAGG-3'， Primer2: 3'-TTGTAGTGGATGGACGGTCG -5'; GAPDH：Primer1:5'- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3', Primer2: 3' -AGGTGACCGCAGAAGTGGT-5'。），按照 Takara 公司基因擴(kuò)增說明書進(jìn)行real-time PCR 反應(yīng)。擴(kuò)增條件：95℃反應(yīng)5s，55℃反應(yīng)30s，總共40 個(gè)循環(huán)。以Ct值表示實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增的結(jié)果，即基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光值達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)。計(jì)算出每組△Ct（CtTarget-CtGAPDH）。Folds=2-△△Ct，其中△△Ct=(Ctl處理樣品待測基因-(Ct1處理樣品待測基因-Ct2處理樣品內(nèi)參基因)-(Ct3對照樣品侍測基因-Ct4對照樣品內(nèi)參基因)， 2-△△Ct即為實(shí)驗(yàn)組基因mRNA 相對于對照組的表達(dá)倍數(shù)。

1.3.4 Western Blotting 檢測PHB 蛋白的表達(dá)：使用RIPA 細(xì)胞裂解液100μl 裂解細(xì)胞，按照SDSPAGE 試劑盒說明書配置分離膠和濃縮膠，每組設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔，上層濃縮膠80V 跑30min，下層分離膠120V 跑1h。用PVDF 轉(zhuǎn)膜，并于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5ml/dl 的牛奶封閉液中封閉2h，依次孵育一抗(1∶5 000稀釋，4℃過夜)和相應(yīng)二抗（1∶1 000稀釋）。在UVP 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯色，Quantity one 軟件計(jì)算灰度值。

1.3.5 MTT 生長曲線測定：設(shè)PHB 高表達(dá)組、陰性對照組及空白對照3 組，每組3 個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染4h后更換成完全培養(yǎng)液，分別于轉(zhuǎn)染后24, 48 和72 h，每孔加入MTT 液20μl，繼續(xù)孵育4 h 后終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)上清液，再加入100 μl DMSO，震蕩 5～10min。以空白培養(yǎng)液組調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測490 nm 波長處各孔的光密度值。細(xì)胞生長抑制率的計(jì)算公式如下：細(xì)胞生長抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組A490nm值/對照組A490nm值。

1.3.6 Transwell 小室侵襲能力檢測：轉(zhuǎn)染48h 時(shí)收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度到2.5×105個(gè)/ml，取200 μl 細(xì)胞懸液加入已鋪好的Martrigel（1∶8 稀釋）小室中繼續(xù)培養(yǎng)16 h。用95ml/dl 乙醇/甲醛和100ml/dl 甲醇依次處理后，用0.1g/dl 結(jié)晶紫染液染20 min， PBS 洗兩次后用棉簽擦拭小室內(nèi)細(xì)胞，將小室倒置于顯微鏡下，隨機(jī)計(jì)數(shù)10 個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)。

1.3.7 流式細(xì)胞儀測周期和凋亡變化：MCF-7 細(xì)胞同步化后分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒，并設(shè)空白對照組，按照細(xì)胞周期試劑盒和凋亡試劑盒處理各組細(xì)胞，用Becton Dickinson 流式細(xì)胞儀檢測DNA-PI的熒光強(qiáng)度，發(fā)射光和激發(fā)光的波長分別是530nm和488nm；Cell Quest V.4.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，Mod Fit LT 軟件系統(tǒng)分析細(xì)胞周期和G1, S, G2 期細(xì)胞比例，以及細(xì)胞凋亡在各種中的比例并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.3.8 腫瘤相關(guān)蛋白測定：按照SDS-PAGE 試劑盒說明檢測三組中PHB 高表達(dá)情況和腫瘤相關(guān)蛋白P53, Bcl-2, E2F-1 和ERBB2 的表達(dá)量，同樣，在UVP 中進(jìn)行顯色，用Quantity one 軟件計(jì)算灰度值，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk 法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（+s）表示，運(yùn)用SPSS19.0 軟件處理數(shù)據(jù)，并用GraphPad Prime 5.0 作圖。兩獨(dú)立樣本間差異比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本組間差異比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 PCR 擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳條帶大小處于750～1 000kb 之間，見圖 1A 所示，回收純化后進(jìn)行DNA 測序，測序結(jié)果與NCBI 中一致。重組質(zhì)粒 pEGFP-PHB 雙酶切后目的條帶位于837kb 左右，符合PHB 基因分子量大小，見圖1B。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7呈多邊形，貼壁生長。轉(zhuǎn)染24h 后觀察載體熒光蛋白表達(dá)量，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)75%以上，見圖1D。

2.2 Real time-PCR 及WesternBlot 檢測PHB 高表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后OE 組，NC 組和MOCK 組提取總RNA 濃度分別為719, 552 和1 004.5ng/μl，A260nm/A280nm比值分別為1.97, 2.0 和1.99，RNA 瓊脂糖凝膠電泳可見28S, 18S 和5S 條帶，見圖2A。Real time-PCR 后各組PHB 的表達(dá)量見圖2B，OE組PHB 表達(dá)量明顯高于NC 組和MOCK 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=790.5,P＜0.0001）。Western Blotting 結(jié)果顯示，OE 組PHB 蛋白表達(dá)明顯高于NC 組和MOCK 組，見圖2C，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.206,P=0.034）。

圖2 Real time PCR 及Western blot 檢測PHB 高表達(dá)

2.3 MTT 檢測細(xì)胞生長 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24, 48 和72h后的細(xì)胞生長曲線見圖3，PHB 高表達(dá)組細(xì)胞吸光度值均低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.74,P=0.034;F=118.5,P＜0.001;F=19.22,P=0.002;）。PHB 在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生長抑制率分別為20.98%, 14.93%和62.94%，即PHB 過表達(dá)后，細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞存活率降低。

圖3 MTT 法細(xì)胞生長曲線測定

2.4 Transwell 小室侵襲能力檢測 侵襲細(xì)胞固定染色后隨機(jī)計(jì)數(shù)10 個(gè)視野， OE 組細(xì)胞數(shù)為54.5±7.4 個(gè)，NC 組細(xì)胞數(shù)為66.0±12.6 個(gè)，MOCK 組細(xì)胞數(shù)為64.0±5.6 個(gè)，OE 組侵襲細(xì)胞數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.221,P=0.012;t=4.057,P=0.003），對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.334,P=0.746）。

2.5 細(xì)胞周期和凋亡檢測 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞固定并用PI 染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。OE 組，NC組和MOCK組的G1期分別為（49.26±6.39）%, （51.36±4.78）% 和（54.41±2.37）%， 三組G1期比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.241,P=0.799）。S 期分別為（14.30±6.97）%，（27.07±4.44）%和（26.54±0.87）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.872，P=0.039）。G2期分別為（34.76±3.51）%，（21.57±2.32）%和（19.04±2.83）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.74,P=0.0342）。

轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞用凋亡試劑盒染色檢測各組細(xì)胞數(shù)量及凋亡比例。OE 組，NC 組和MOCK 組細(xì)胞凋亡率分別為（33.67±8.68）%，（12.13±3.76）%和（6.99±2.33）%，OE組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.992,P=0.003），NC 組與MOCK 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.350,P=0.079）。

2.6 腫瘤相關(guān)蛋白檢測 SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果見圖4。P53 和ERBB2 蛋白表達(dá)量OE 組高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.590,P=0.44；t=9.489,P=0.011）；Bcl-2 蛋白OE組低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.143,P=0.019)；E2F-1 蛋白水平OE 組與NC 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.175,P=0.162)。

圖4 腫瘤相關(guān)蛋白檢測

3 討論

抗增殖蛋白（Prohibitin，phb/PHB），亦稱阻抑素，因具有細(xì)胞增殖抑制功能而得名，是一種高度同源保守的蛋白質(zhì)，在染色體上位于17q21，長11kb。其兩種亞型PHB1 和PHB2 相互纏繞形成指環(huán)樣結(jié)構(gòu)，維持線粒體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能完整性[2,8]。PHB 蛋白功能豐富多樣，參與細(xì)胞多個(gè)進(jìn)程，包括增殖抑制、能量調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、分化凋亡和免疫調(diào)控等[9]。近年來，乳腺癌已成為全球女性首位惡性腫瘤，發(fā)病率和致死率也逐年升高，在我國，其發(fā)病率明顯年輕化。自1992年P(guān)HB 基因多態(tài)性與乳腺癌易感性的研究開始，越來越多的學(xué)者關(guān)注其作用機(jī)制，日本學(xué)者KIM 等[10]從乳腺癌治療方面亦證實(shí)PHB 發(fā)揮重要作用。

本次研究結(jié)果顯示，PHB 高表達(dá)后細(xì)胞存活率降低，S 期的比例降低，這與大多數(shù)研究者的結(jié)果相符，表明PHB 抑制了乳腺癌細(xì)胞MCF-7 的生長，使細(xì)胞處于低增殖的狀態(tài)，這可能與S 期DNA 合成減少及G2/M 期細(xì)胞阻滯有關(guān)。S 期是細(xì)胞間期DNA 合成的重要時(shí)期，DNA 合成的不足或者缺陷將影響細(xì)胞分裂期的進(jìn)行以及細(xì)胞功能完整性。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PHB 對細(xì)胞的增殖抑制主要是通過對正性調(diào)控因子E2F 家族蛋白的抑制和抑癌基因P53 的活化來實(shí)現(xiàn)的[10,14]，本次研究也發(fā)現(xiàn)PHB 高表達(dá)時(shí)，P53 表達(dá)水平增高（t=9.489,P=0.011），提示P53確實(shí)參與增殖抑制通路，而E2F-1 的表達(dá)未發(fā)生變化（t=2.175,P=0.162），不能支持 P53 作為E2F-1上游調(diào)控因子參與PHB 作用機(jī)制的觀點(diǎn)。PHB 可能通過P53 的途徑抑制細(xì)胞增殖，或是激活Ras-Raf-MEK-ERK 途徑來發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖作用[9,13]，需要進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證。

除此以外，PHB 的高表達(dá)使得細(xì)胞凋亡增加，同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 水平減低，分析其原因可能是PHB 和Bcl-2 都具有穩(wěn)定線粒體的功能，Bcl-2 的降低使得線粒體膜穩(wěn)定性下降，線粒體外膜蛋白MOMP 和線粒體內(nèi)膜蛋白如細(xì)胞色素C 的釋放增加，導(dǎo)致能量代謝障礙而引起細(xì)胞凋亡數(shù)量和比例增加。與乳腺癌侵襲性、治療及預(yù)后緊密相關(guān)的人類表皮生長因子ERBB2，即Her2 基因，可為Her2 陽性乳腺癌患者提供有效的治療效果[14]，針對Her2 陽性乳腺癌已有好的靶向藥物，包括曲妥珠 / 帕妥珠單抗等。在本次研究中，PHB高表達(dá)時(shí)Her2 蛋白水平增高，有望提高靶向藥物治療效果，可以增加激素和化療藥物的敏感性，同時(shí)降低乳腺癌的侵襲性，若PHB 和ERBB2 能夠聯(lián)合應(yīng)用于Her2 陽性乳腺癌患者，將可能為乳腺癌治療開辟新的路徑。

由上述分析可知：PHB 高表達(dá)在細(xì)胞水平具有抑制細(xì)胞增殖的功能，同時(shí)使得細(xì)胞凋亡增加，整體表現(xiàn)出抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 生長的現(xiàn)象。進(jìn)而探索導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制的分子水平變化，提示癌基因P53、正性轉(zhuǎn)錄因子E2F-1、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 在PHB 對乳腺癌細(xì)胞的生長抑制過程中發(fā)揮重要作用。該研究為PHB 在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能提供了可靠資料，并對PHB 抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制進(jìn)行深入細(xì)致的研究，需要進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。