周 琰， 王蓓麗,2，張春燕,2，潘柏申,2，郭 瑋,2

（1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建廈門 361015）

二十世紀(jì)中期，DUSCHINSKY 等首次報(bào)道合成5-氟尿嘧啶（Fluorouracil，5-FU，它作為氟嘧啶類抗腫瘤藥物的關(guān)鍵中間體，通過進(jìn)一步代謝和轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物，抑制RNA 和DNA 合成，發(fā)揮抗腫瘤作用[1-2]。5-FU 常與奧沙利鉑、靶向藥物等抗腫瘤藥物聯(lián)合使用， 是治療消化道實(shí)體腫瘤如結(jié)腸直腸癌、胃癌等最常用的化療方案[3-4]。

在腫瘤晚期患者中，使用含氟尿嘧啶作為基礎(chǔ)治療方案的化療敏感性只有22%，使用相同劑量的患者對藥物的敏感性差異很大，影響了治療效果。隨著對人類基因組計(jì)劃的深入了解，學(xué)者們開始嘗試從藥物基因組學(xué)、藥物遺傳學(xué)的角度研究5-FU 相關(guān)藥物基因?qū)熜Ч筒涣挤磻?yīng)的影響[5]。本文旨在研究亞甲基四氫葉酸還原酶（5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR）基因和毒性預(yù)測的相關(guān)性，為個體化治療提供依據(jù)[6]。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2016年2～6月，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院就診的123 例消化道惡性腫瘤患者，其中，男性67 例，女性56 例；年齡32～83 歲，中位年齡61 歲。從外周血樣品中提取基因組DNA 用于檢測MTHFR 1298A＞C 和MTHFR677C＞T 基因多態(tài)性。統(tǒng)計(jì)98 例治療方案中含5-FU 的患者，比較基因型不同的患者之間發(fā)生不良反應(yīng)類別和程度的差異。98 例患者接受5-FU 聯(lián)合奧沙利鉑的化療方案，根據(jù)體表面積計(jì)算藥物劑量。隨訪期間未發(fā)生黃疸和消化道梗阻、造血功能障礙和不伴急性感染。

1.2 儀器和試劑Applided Biosystems 7500 Fast Realtime PCR System[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；AB 3130 型測序儀（美國 ABI 公司）。Lab-Aid 820 核酸抽提Midi 試劑（廈門致善生物科技股份有限公司）；Permix Taq@Hot Start Version[寶生物工程（大連）有限公司]；測序試劑[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集及DNA 提取：收集患者治療期間的EDTA-K2抗凝血2ml。使用Lab-Aid 820 核 酸抽提Midi 試劑，嚴(yán)格按照說明書要求抽提基因組DNA，并保存于-20℃直至檢測。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及合成：MTHFR 1298A＞C 和MTHFR 677C＞T基因型測定，采用Oligo7 軟件設(shè)計(jì)PCR引物：MTHFR (1298A＞C) F：AGCTGAAGGACTACTACCTCT；MTHFR (1298A＞C) R：CCCACTCCAGCATCACTCAC；MTHFR (677C＞T) F：CCTATTGGCAGGTTACCCCA；MTHFR (677C＞T) R： CATGCCTTCACAAAGCGGAA。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增：將Premix Taq@Hot Start Version 反應(yīng)液、正向/反向引物和去離子水，按表1 依次加入0.2 ml PCR 反應(yīng)管中，PCR 反應(yīng)總體積為20 μl，震蕩混勻后瞬時離心備用。

表1 PCR 擴(kuò)增體系配置表

反應(yīng)條件：94℃，5min；45 次循環(huán)（94℃30s；61℃30s；72℃，30s）；72℃5min；4℃，保溫。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后在ABI3730 測序儀上雙相測序，使用Chromas 軟件分析測序結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.4.1 數(shù)據(jù)收集 ：每4 周為一個化療周期，接受2 ～6 次化療。通過整理病史，結(jié)合影像學(xué)和實(shí)驗(yàn)室結(jié)果評估不良反應(yīng)和嚴(yán)重程度。

1.4.2 藥物毒性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)美國國立癌癥研究所（National Cancer Institute， NCI）提出的常見不良反應(yīng)事件評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（CTCAE Version 4.0）對胃腸道不良反應(yīng)和血液系統(tǒng)不良反應(yīng)進(jìn)行評價(jià)和分級，主要包括白細(xì)胞減少、腹瀉、嘔吐和脫發(fā)等。

1.4.3 研究終點(diǎn)事件和數(shù)據(jù)分析：主要終點(diǎn)事件為5-FU 相關(guān)的不良事件。使用SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)或 Fisher's 精確概率法，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR A1298C 和 C677T 基因多態(tài)性分布情況123 例消化道腫瘤患者的MTHFR A1298C 和 C677T 基因多態(tài)性分布見表2。其中，接受5-FU聯(lián)合鉑類化療的98 例患者各基因型分布情況與入組的總體情況相似，見表3（P＞0.05）。

表2 123 例消化道腫瘤患者M(jìn)THFR A1298C 和 C677T 基因多態(tài)性分布情況

2.2 123 例消化道惡性腫瘤患者M(jìn)THFR 基因的等位基因頻率和Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)在入組患者中分析了MTHFR A1298C 和C677T 等位基因頻率的遺傳平衡。結(jié)果顯示，MTHFR A1298C 基因型中，A 和C 等位基因頻率分別為78.05%和21.95%（P=0.87）；MTHFR C677T 基因型中，C 和T 等位基因頻率分別為65.45%和34.55%（P=0.29）。抽樣樣本符合Hardy-Weinberg 平衡定律，具有群體代表性。

對MTHFR A1298C 多態(tài)性進(jìn)行測序，結(jié)果見圖1。對MTHFR C677T 多態(tài)性進(jìn)行測序，結(jié)果見圖2。

表3 98 例接受5-FU 治療患者M(jìn)THFR A1298C 和 C677T 基因多態(tài)性分布情況

圖1 MTHFR A1298C 三種基因型AA，AC，CC 的 Sanger 測序結(jié)果圖

圖2 MTHFR C677T 三種基因型CC，CT，TT 的 Sanger 測序結(jié)果圖

2.3 消化道腫瘤患者年齡、性別、化療方案和MTHFR 基因型與不良反應(yīng)的關(guān)系見表4。根據(jù)單因素χ2檢驗(yàn)?zāi)Ｐ头治鼋Y(jié)果，5-FU 相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生率與年齡、性別、化療方案、MTHFR A1298C 多態(tài)性之間無顯著相關(guān)（P＞0.05），但與MTHFR C677T 多態(tài)性存在相關(guān)性（P＜0.001）。

2.4 消化道腫瘤患者中MTHFR 基因型和藥物不良反應(yīng)情況及程度見表5。98 例消化道腫瘤患者中，35 例MTHFR C666T 野生型（CC）患者中發(fā)生3～4 級消化道不良反應(yīng)0 例；3～4 級中性粒細(xì)胞減少1 例。在63 例MTHFR C666T 突變型（CT+TT）患者，發(fā)現(xiàn)11 例3～4 級消化道不良反應(yīng)；3 例3～4 級中性粒細(xì)胞減少癥。65 例MTHFR A1298C 野生型（AA）患者，發(fā)現(xiàn)2 例3～4 級消化道不良反應(yīng)；3～4 級中性粒細(xì)胞減少癥0 例。33 例MTHFR A1298C 突變型（AC+CC）患者，發(fā)現(xiàn)4例3～4 級消化道不良反應(yīng)；3～4 級中性粒細(xì)胞減少癥1 例。MTHFR C677T 突變基因型（CT+TT）可以增加3 級以上不良反應(yīng)和消化道不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，不增加中性粒細(xì)胞減少癥的風(fēng)險(xiǎn)。MTHFR A1298C 基因型不增加患者3 級以上不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

3 討論

5-FU 通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶抑制DNA 合成，是一類具有廣譜抗腫瘤作用的抗嘧啶類藥物。它被單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于各種實(shí)體腫瘤治療方案。5-FU 的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量通常是根據(jù)患者體表面積計(jì)算而得，但在實(shí)際臨床應(yīng)用中，使用相同校準(zhǔn)劑量的患者藥物療效和不良反應(yīng)發(fā)生程度存在顯著差異，甚至發(fā)生藥物不敏感和嚴(yán)重致死性不良反應(yīng)[7-8]。據(jù)報(bào)道，多個基因多態(tài)性在抗嘧啶類藥物代謝過程中起著重要作用，例如二氫嘧啶脫氫酶（dihydropymidine dehydrogenase ，DPD）、 胸 腺嘧啶核苷酸合成酶（thymidylate synthase, TS）、胸腺嘧啶磷酸化酶（thymidine phosphorylase, TP）和MTHFR 等基因的多態(tài)性。在本文中，我們研究通過葉酸代謝途徑，由MTHFR 基因C677T 和A1298C 多態(tài)性引起的藥物毒副作用，協(xié)助臨床選擇合適的化療藥物，推進(jìn)個體化精準(zhǔn)醫(yī)療[9-12]。

本研究中MTHFR C677T 和A1298C 等位基因頻率遺傳平衡P＞0.05，說明抽樣樣本代表了一個處于隨機(jī)婚配平衡狀態(tài)的大規(guī)模群體，符合吻合度檢驗(yàn)要求。

我們的研究中，漢族人群MTHFR C677T 突變基因型（CT+TT）的頻率（59.3%） 高于MTHFR A1298C 突變基因型（AC+CC）的頻率（38.2%），更為常見。其中，MTHFR C677T 基因型檢測結(jié)果，野生型 CC 50 例（40.65%）,雜合子CT 61 例（49.59%）和純合子TT 12 例（9.76%），與文獻(xiàn)報(bào)道（野生型48.6%，雜合突變型45.8%，純合突變型5.6%）相一致；A1298C 基因多態(tài)性頻率和Pubmed 索引的結(jié)果基本一致（野生型59.0%，雜合突變型34.9%，純合突變型6.1%）[10,13-14]。

5-FU 相關(guān)不良反應(yīng)呈劑量限制性[15-17]，同時體內(nèi)代謝過程為非線性方式，進(jìn)一步加劇了個體間的療效差異。98 例采用5-FU 聯(lián)合鉑類化療方案的患者均使用小劑量44h 連續(xù)靜脈滴注的給藥方式，排除劑量差異對毒副作用分析的影響。

根據(jù)χ2檢驗(yàn)結(jié)果，5-FU 相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生與年齡、性別、化療方案、MTHFR A1298C 多態(tài)性無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。然而，它與MTHFR C677T 基因多態(tài)性存在相關(guān)（P＜0.05），這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。

5-FU 作為廣譜的實(shí)體腫瘤化療藥物，使用過程中常見的不良反應(yīng)一直受到臨床普遍關(guān)注，主要包括胃腸道反應(yīng)，尤其是致死性出血性腹瀉。在嚴(yán)重的情況下，骨髓抑制可誘發(fā)三系下降，全血細(xì)胞減少，以及脫發(fā)、共濟(jì)失調(diào)等[18]。多年來，持續(xù)有研究報(bào)道了5-FU 相關(guān)不良反應(yīng)。2000年后，學(xué)者們開始從藥物基因組學(xué)角度來研究上述不良反應(yīng)發(fā)生的原因。MTHFR 是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，可將還原型葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基四氫葉酸（5-MTHF），使一磷酸脫氧核糖氟尿嘧啶核苷（fluorodeoxyuridylate，F(xiàn)dUMP）、TS 和還原型葉酸組成的復(fù)合物減少，從而減弱5-FU 的腫瘤抑制作用[19]。

最常見的MTHFR 基因多態(tài)性是第677 位密碼子發(fā)生T 到C 的突變。SOHN 等[20]在結(jié)腸癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶變異型的癌細(xì)胞MTHFR 活性降低，細(xì)胞增殖速度加快，相對5-FU 的敏感性也增高。MTHFR基因型對細(xì)胞內(nèi)葉酸濃度和分布也有影響，進(jìn)而改變腫瘤細(xì)胞生長速度和藥物敏感性。

本研究中，MTHFR C677T基因突變型（CT+TT）患者中，共發(fā)生不良反應(yīng)21 例，其中3～4 級嚴(yán)重胃腸道不良反應(yīng)11 例，3～4 級中性粒細(xì)胞減少3例。MTHFR C677T 突變型顯著增加了3 ～4 級不良反應(yīng)的發(fā)生率和3～4 級胃腸道不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.05），這和國內(nèi)外研究數(shù)據(jù)是一致的[10,19]。MTHFR 基因多態(tài)性對酶活性有明顯影響，攜帶MTHFR 677C＞T 等位基因的患者在化療過程中發(fā)生消化系統(tǒng)和血液系統(tǒng)不良反應(yīng)的概率及療效有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有報(bào)道攜帶MTHFR 677C＞T 基因突變型（CT+TT）的患者，在使用 MTX 后發(fā)生腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)高于野生型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

有文獻(xiàn)報(bào)道MTHFR C677T 多態(tài)性會增加血液系統(tǒng)不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，例如白細(xì)胞減少、血小板減低[21]。然而，我們的研究中MTHFR C677T 多態(tài)性不增加中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。這可能是由于：①采血時間和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道有差異。為了避免化療后發(fā)生感染等危險(xiǎn)并發(fā)癥，本研究在化療結(jié)束后14 天復(fù)查血細(xì)胞檢測，錯過血液學(xué)變化最顯著的化療后第7 天。②入組樣本例數(shù)有限。后續(xù)，我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量再行分析。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明MTHFR C677T 多態(tài)性可增加5-FU 相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生率，尤其是3 ～4 級胃腸道反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)；MTHFR A1298C 多態(tài)性、年齡、性別和化療方案與5-FU 相關(guān)的不良事件無顯著相關(guān)性。檢測MTHFR 基因多態(tài)性可以幫助臨床制定個性化化療方案，預(yù)測和減少不良反應(yīng)的發(fā)生。