趙凱 王志武 楊俊泉

[摘要] 目的 分析糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系。 方法 收集2010年1月～2014年12月河北省唐山市人民醫(yī)院接收手術(shù)治療膠質(zhì)瘤148患者的組織標(biāo)本和臨床病理資料。根據(jù)GSK-3β表達(dá)水平將其分為GSK-3β高表達(dá)組（85例）和GSK-3β低表達(dá)組（63例）。收集兩組年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)徑（<4 cm，≥4 cm），腫瘤位置（額葉、顳葉、其他），WHO分級(jí)資料，免疫組化檢測(cè)GSK-3β在組織中的表達(dá)，Kaplan-Meier分析和Cox回歸分析GSK-3β表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后關(guān)系。 結(jié)果 GSK-3β表達(dá)水平與WHO分級(jí)明顯相關(guān)（P < 0.05）。GSK-3β高表達(dá)組的總生存時(shí)間短于GSK-3β低表達(dá)組（HR=2.31，95%CI：1.87～4.15，P < 0.01）。GSK-3β高表達(dá)、WHO高分級(jí)是預(yù)后不良的影響因素。結(jié)論 GSK-3β高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)，是其不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

[關(guān)鍵詞] 膠質(zhì)瘤;糖原合成酶激酶-3β;預(yù)后;免疫組化

[中圖分類號(hào)] R739.4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）06（b）-0113-04

Relationship between GSK-3β and prognosis in patients with glioma

ZHAO Kai? ?WANG Zhiwu? ?YANG Junquan

The First Department of Chemoradiotherapy， Tangshan People′s Hospital， Hebei Province， Tangshan? ?063000， China

[Abstract] Objective To analyze the relationship between glycogen synthase kinase-3β （GSK-3β） expression and prognosis of glioma patients. Methods Tissue specimens and clinical pathological data of 148 cases who received surgical treatment for glioma in Tangshan People′s Hospital of Hebei Province from January 2010 to December 2014 were collected. According to the expression of GSK-3β， they were devided into GSK-3β high-expression group （85 cases） and GSK-3β low-expression group （63 cases）. Age， gender， tumor length and diameter （<4 cm， ≥4 cm）， tumor location （frontal lobe， temporal lobe， others）， WHO grading data of two groups were collected. Immunohistochemical analysis of GSK-3β expression in tissues， Kaplan-Meier analysis and Cox regression analysis of the relationship between GSK-3β expression and the prognosis of glioma patients. Results GSK-3β expression level was significantly correlated with WHO grade （P < 0.05）. The total survival time of GSK-3β high-expression group was shorter than that of GSK-3β low-expression group （HR=2.31， 95%CI： 1.87-4.15， P < 0.01）. High GSK-3β expression and WHO grade were the factors affecting poor prognosis. Conclusion The high expression of GSK-3β is related to the poor prognosis of glioma patients， and it is an independent predictor of poor prognosis.

[Key words] Glioma; Glycogen synthetase kinase-3β; Prognosis; Immunohistochemistry

膠質(zhì)瘤是成人原發(fā)性腦腫瘤中最具侵襲性的類型，包括星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突-星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞和室管膜瘤[1]。膠質(zhì)瘤又可分為WHO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級(jí)，級(jí)別越高，惡性程度越高;對(duì)于WHO Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤患者，中位生存時(shí)間只有12～15個(gè)月，對(duì)于Ⅲ級(jí)和低級(jí)別（Ⅰ和Ⅱ級(jí)）膠質(zhì)瘤患者，生存期雖然可超過(guò)兩年，但因?yàn)槠渚哂懈叨惹忠u性和對(duì)治療的抵抗，預(yù)后也不盡如意[2-3]。盡管臨床實(shí)踐中已經(jīng)運(yùn)用多種策略，包括通過(guò)預(yù)測(cè)工具、分子和遺傳信息來(lái)輔助膠質(zhì)瘤的診治管理，但腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)仍然是一個(gè)重要問(wèn)題。近5年來(lái)，膠質(zhì)瘤的治療方法有所改進(jìn)，但患者的中位生存率并不令人滿意。因此，有必要探索新的癌癥相關(guān)基因，來(lái)作為膠質(zhì)瘤治療預(yù)后標(biāo)志物[4]。

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是一種多功能的Ser/Thr激酶，包括α和β兩種亞型，最初被認(rèn)為是糖原代謝和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)[5]。GSK-3β是其亞型之一，在多種信號(hào)通路起核心作用，如Wnt/β-catenin和Akt等[6-7]。GSK-3β的失調(diào)也與腫瘤發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，如前列腺癌、胃癌和食管癌等[8]。Zhao等[9]研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β可以調(diào)節(jié)mTOR/p70S6K1信號(hào)通路，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。然而，GSK-3β的表達(dá)情況在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中臨床意義尚不明確。本研究分析了GSK-3β表達(dá)與膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月～2014年12月河北省唐山市人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）接收手術(shù)治療的腦膠質(zhì)瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤，②病歷資料且隨訪信息完整;③患者了解本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有高血壓、糖尿病、冠心病等慢性疾病，肺炎、肝炎和肺結(jié)核等急慢性感染者;②術(shù)前接受過(guò)放化療或患有其他惡性腫瘤者。本研究共納入研究對(duì)象148例，平均年齡（56.0±9.8）歲，其中男67例，女81例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

本研究所用標(biāo)本均來(lái)自我院腦外科術(shù)后的組織標(biāo)本。因研究為回顧性研究，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)所有患者均已完成病理相關(guān)診斷，術(shù)后組織標(biāo)本均已包埋于石蠟中儲(chǔ)存。免疫組織化學(xué)檢測(cè)，神經(jīng)膠質(zhì)組織包埋在石蠟中，然后在4 μm切片機(jī)上進(jìn)行切片。切片放置在載玻片上，在不同的時(shí)間段里使用不同濃度的酒精溶液（75%、80%、90%、95%、100%）脫水，使用二甲苯進(jìn)行清洗。本研究采用兩步間接免疫組化染色法。將針對(duì)人GSK-3β的兔抗體（Solarbio公司，貨號(hào)：K000492P，生產(chǎn)批號(hào)：20180804）分別稀釋至1∶200和1∶250?？贵w染色后，4℃過(guò)夜。采用過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗與3，3′-二氨基苯并苯胺（DAB）底物-染色原反應(yīng)，用于福爾馬林固定石蠟包埋組織切片。在切片上與DAB反應(yīng)可在抗原部位產(chǎn)生不溶于乙醇和二甲苯的棕色產(chǎn)物。切片用磷酸緩沖鹽溶液（北京中杉金橋公司，貨號(hào)：ZLI-9062，生產(chǎn)批號(hào)：20190102）沖洗3次，然后應(yīng)用光學(xué)顯微鏡以200倍的放大率觀察組織中靶蛋白的表達(dá)。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，并計(jì)算免疫組化的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，百分比≥50%為高表達(dá)，<50%為低表達(dá)，根據(jù)GSK-3β表達(dá)水平將其分為GSK-3β高表達(dá)組和GSK-3β低表達(dá)組。

1.3 觀察指標(biāo)

收集受試者年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)徑（<4 cm，≥4 cm），腫瘤位置（額葉、顳葉、其他），WHO分級(jí)（Ⅰ/Ⅱ，Ⅲ/Ⅳ），其中腫瘤長(zhǎng)徑、位置、WHO分級(jí)分組統(tǒng)計(jì)的分組方法參考經(jīng)典文獻(xiàn)[9-10];觀察GSK-3β表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn);采用多因素Kaplan-Meier和cox回歸進(jìn)行相關(guān)性分析，以P < 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤患者一般資料及臨床病理參數(shù)與GSK-3β表達(dá)水平的關(guān)系

兩組年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)徑、腫瘤位置比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。兩組卡氏功能狀態(tài)評(píng)分（KPS）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;GSK-3β表達(dá)水平與腫瘤WHO分級(jí)有關(guān)（P < 0.05）。

2.2 GSK-3β表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系

GSK-3β高表達(dá)組的總生存時(shí)間短于GSK-3β低表達(dá)組（HR=2.31，95%CI：1.87～4.15，P < 0.01）;Ⅲ/Ⅳ級(jí)預(yù)后比Ⅰ/Ⅱ級(jí)更差（HR=1.34，95%CI：1.21～2.69，P < 0.05）。多因素Cox回歸分析提示，GSK-3β高表達(dá)、WHO高分級(jí)是預(yù)后不良的影響因素。見圖1、表2。

3 討論

近年來(lái)盡管在手術(shù)、放療和化療方面取得了進(jìn)展，但膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然較差。膠質(zhì)瘤患者尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的1、3、5年相對(duì)生存率分別低于30%、5%、3%[14]。因此，尋找并確認(rèn)膠質(zhì)瘤的預(yù)后因子對(duì)提高膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后和治療至關(guān)重要。分子水平的標(biāo)志物在多種不同癌癥類型的檢測(cè)和治療中發(fā)揮重要作用，包括各種腦部疾病[11]。Cheng等[12]結(jié)果顯示，PAX6作為miR-335的新靶點(diǎn)，在膠質(zhì)瘤中具有抗癌作用，推測(cè)PAX6可能作為治療膠質(zhì)瘤的靶點(diǎn)。本研究嘗試探討GSK-3β在判斷腦膠質(zhì)瘤中的預(yù)后作用。

局部浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和血管生成是膠質(zhì)瘤的主要特征，因此，腫瘤增殖、侵襲、及血管生成的分子標(biāo)志物均有可能是膠質(zhì)瘤的預(yù)后因子。GSK-3β最初被認(rèn)為是糖原合成酶激酶的限速酶，之后研究提示GSK-3β除在糖代謝中起作用外，其生物學(xué)作用尚與腫瘤的増殖、侵襲、調(diào)亡及血管生成等過(guò)程密切相關(guān)[8]。最近的研究[13]顯示，GSK-3β是一個(gè)腫瘤抑制組分的相關(guān)分子之一，因?yàn)槠湓谀[瘤中可以直接磷酸化β-catenin蛋白，執(zhí)行靶向降解。研究顯示，GSK-3β在多種人類癌癥中存在特異性表達(dá)[14]，如Wang等[15]認(rèn)為SOX9 mRNA的過(guò)表達(dá)與惡性膠質(zhì)瘤患者臨床預(yù)后不良密切相關(guān)，靶向SOX9可能是一種新的治療策略。GSK-3β在膠質(zhì)瘤中的作用有較多的基礎(chǔ)研究[16]，Miyashita等[17]比較了23例膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織樣本中的GSK-3β表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織較周圍正常組織的GSK-3β表達(dá)水平更高而靶向GSK-3β的特異性小分子抑制劑可減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞的増殖能力，促進(jìn)其凋亡。Zhao等[9]在體外研究中分別應(yīng)用GSK-3β抑制劑或RNAi干擾技術(shù)抑制GSK-3β的表達(dá)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲增強(qiáng)，同時(shí)其凋亡率減低。Yang等[18]揭示GSK-3β是通過(guò)磷酸化53BP1誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞核中的DNA DSB修復(fù)，有可能是增強(qiáng)放療敏感性的治療靶點(diǎn)。Zhou等[19]研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β促進(jìn)組蛋白脫甲基酶KDM1A的累積，并在腫瘤發(fā)生過(guò)程中調(diào)節(jié)組蛋白H3K4甲基化，導(dǎo)致癌癥干細(xì)胞自我更新和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生。此外，GSK3抑制劑Tideglusib使小鼠移植瘤對(duì)化療敏感性增強(qiáng)，并提高其生存率[7，19-20]。

然而，GSK-3β在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的臨床作用尚不清楚。在目前的研究中，本研究調(diào)查了GSK-3β表達(dá)與沒(méi)有接受放化療的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GSK-3β高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)。GSK-3β的表達(dá)明顯受到WHO分級(jí)的影響，GSK-3β可能參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。Kaplan-Meier生存分析顯示，GSK-3β高表達(dá)組的總生存時(shí)間短于GSK-3β低表達(dá)組（P < 0.05），提示GSK-3β表達(dá)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后相關(guān)。多因素生存分析進(jìn)一步證實(shí)GSK-3β高表達(dá)與不良預(yù)后的關(guān)系，提示GSK-3β高表達(dá)可能是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。

本研究尚存在一些局限性，首先本研究為回顧性研究，不可避免的會(huì)出現(xiàn)相關(guān)的研究偏倚，該結(jié)果尚需前瞻性研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。另外本研究為單中心的研究，樣本量有限，這需要多中心的研究來(lái)進(jìn)行下一步的確證性研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)，是其不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，將來(lái)應(yīng)該進(jìn)一步研究其分子機(jī)制，開發(fā)以其為靶點(diǎn)的靶向藥物。

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（收稿日期：2019-12-06? 本文編輯：劉明玉）