徐智 劉春燕 溫娟 劉紹華

[摘要] 目的 探討吳茱萸堿對缺氧微環(huán)境下膽囊癌細(xì)胞（GBC-SD）增殖及缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)的影響。 方法 以3%O2、5%CO2模擬缺氧微環(huán)境，將GBC-SD分為正常對照組、缺氧組、吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組，分別置于常氧和缺氧微環(huán)境下培養(yǎng)。MTT法檢測各組12、24、48、72、96 h細(xì)胞增殖能力;Annexin V-FITC/PI雙染流式法檢測各組細(xì)胞凋亡情況;Western blot檢測各組細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)狀況。 結(jié)果 MTT結(jié)果顯示：12 h三組間細(xì)胞的光密度值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;24、48、72、96 h缺氧組細(xì)胞的光密度值低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;24、48、72、96 h吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組細(xì)胞的光密度值低于缺氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。流式細(xì)胞結(jié)果顯示：缺氧組細(xì)胞凋亡率高于正常對照組（P < 0.05）;吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組的細(xì)胞凋亡率高于正常對照組和缺氧組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、VEGF的蛋白表達(dá)均低于正常對照組和缺氧組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。 結(jié)論 吳茱萸堿能夠抑制缺氧微環(huán)境下GBC-SD增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這可能與吳茱萸堿抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α和VEGF的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 吳茱萸堿;膽囊癌;缺氧誘導(dǎo)因子1α;血管內(nèi)皮生長因子

[中圖分類號(hào)] R735.8? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）06（b）-0030-04

Effects of evodotaxine on the proliferation of gallbladder carcinoma cells and the expression of HIF-1α and VEGF in anoxic microenvironment

XU Zhi1? ?LIU Chunyan2? ?WEN Juan1? ?LIU Shaohua3

1.Department of Clinical Medicine， Pingxiang Health Vocational College， Jiangxi Province， Pingxiang? ?337000， China; 2.Department of Nursing， Pingxiang Health Vocational College， Jiangxi Province， Pingxiang? ?337000， China; 3.Department of Hepatobiliary Surgery， Pingxiang People′s Hospital， Jiangxi Province， Pingxiang? ?337000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of evodotaxine on the proliferation of gallbladder carcinoma cells （CBC-SD） and the expression of hypoxia-inducing factor 1α （HIF-1α） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in GBC-SD in anoxic microenvironment. Methods Using 3%O2 and 5%CO2 to simulate anoxic microenvironment， CBC-SD cells were divided into normal control group， hypoxic group and evodotaxine （100 μg/mL） + hypoxic group， they were cultured in normal and hypoxic microenvironments. MTT assay was used to detect the proliferation of 12， 24， 48， 72 and 96 h cells in each group. Annexin V-FITC/PI double staining flow method was used to detect apoptosis in each group. HIF-1α， VEGF protein expression was detected by Western blot. Results MTT results showed that there was no statistically significant difference in the optical density values between the three groups at 12 h （P > 0.05）. At 24， 48， 72 and 96 h， the optical density of the hypoxia group was lower than that of the normal control group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. At 24， 48， 72， and 96 h， the light density value of evodotaxine （100 μg/mL） + hypoxia group was lower than that of the hypoxia group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Flow cytometry results showed that the apoptosis rate of hypoxia group was higher than that of normal control group （P < 0.05）. The apoptosis rate of evodotaxine （100 μg/mL） + hypoxia group was higher than that of normal control group and hypoxia group， and the difference was statistically significant （all P < 0.05）. The protein expression of the HIF-1α， VEGF in the cells of the evodotaxine （100 μg/mL） + anoxic group was lower than that of the normal control group and the hypoxic group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Conclusion Evodotaxine can inhibit the proliferation of GBC-SD cells in gallbladder cancer under hypoxic microenvironment and promote apoptosis， which may be related to evodotaxine′s inhibition of HIF-1α and VEGF expression in tumor cells.

[Key words] Evodiamine; Gallbladder carcinoma; Hypoxia-inducing factor 1α; Vascular endothelial growth factor

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，近年來該病的發(fā)生率和死亡率均有明顯上升趨勢[1-2]。長期以來，膽囊癌因其發(fā)病隱匿、病情進(jìn)展迅速、手術(shù)切除率較低等特點(diǎn)，使該病在早期診斷及治療方面沒有取得有效進(jìn)展，加之手術(shù)及放化療的效果不理想，患者預(yù)后不佳[3]。因此，急需尋找一種有效治療膽囊癌的方法。

吳茱萸堿是中藥吳茱萸的有效成分，它不僅能調(diào)節(jié)免疫，同時(shí)也能抑制腫瘤增殖，促進(jìn)腫瘤凋亡[4-5]，但其具體的抗腫瘤分子機(jī)制仍不明確。本研究采用人膽囊癌細(xì)胞（GBC-SD）作為研究對象，探討吳茱萸堿對GBC-SD增殖的影響及相關(guān)分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料與細(xì)胞培養(yǎng)

DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，貨號(hào)：SH30022.01）;胎牛血清（GIBCO，貨號(hào)：42F7180K）;Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Biolegend）;血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）兔抗人多克隆抗體（Abclonal，貨號(hào)：A2556）;缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）鼠抗人多克隆抗體（Abcam，貨號(hào)：Ab113642），胰酶（Genview，貨號(hào)：89040101100），MTT（Genview，貨號(hào)：298-93-1）。熒光倒置顯微鏡（日本Nikon），流式細(xì)胞儀（美國BD），酶標(biāo)儀（美國Thermo Labsystems），化學(xué)發(fā)光儀（上海勤翔）。GBC-SD（購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫）置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃飽和濕度、含5%CO2的常氧孵箱中培養(yǎng);以37℃飽和濕度，含3%O2、5%CO2的條件模擬腫瘤細(xì)胞缺氧環(huán)境。

1.2 MTT法檢測GBC-SD增殖能力

分組：正常對照組（常氧組），缺氧組（模擬缺氧環(huán)境），吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組。取對數(shù)生長期的GBC-SD懸液，以0.8×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中培養(yǎng)，放于常氧和缺氧環(huán)境下各培養(yǎng)24 h，按照分組加入?yún)擒镙菈A100 μg/mL，再繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72、96 h;棄培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min;選擇490 nm波長測定各孔吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測GBC-SD的凋亡情況

采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。細(xì)胞分組同MTT法，取處于對數(shù)生長期的GBC-SD懸液，以密度為3.5×104個(gè)/孔接種到6孔板中，放于常氧和缺氧環(huán)境下各培養(yǎng)24 h，按分組加入?yún)擒镙菈A100 μg/mL，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次后加入Annexin V-PI，再加入FITC于室溫下孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blot檢測VEGF、HIF-1α蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分組同MTT法，提取各組細(xì)胞的總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度檢測。分別制備濃縮膠和分離膠，加樣后進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，用含有5%脫脂牛奶封閉后，分別用一抗（稀釋倍數(shù)1∶1000）、二抗（稀釋倍數(shù)1∶1000）在室溫下孵育1 h，后在暗室內(nèi)加超敏發(fā)光液孵育5 min，放于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，采用Image J分析軟件進(jìn)行圖像分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t多重檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞光密度值比較

三組GBC-SD光密度值在12 h時(shí)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;與正常對照組比較，24、48、72、96 h缺氧組細(xì)胞光密度值均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）;與缺氧組比較，吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組24、48、72、96 h的細(xì)胞光密度值均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見表1。

2.2 各組凋亡情況比較

三組GBC-SD的凋亡率分別：正常對照組為（6.97±0.36）%、缺氧組為（17.43±0.29）%、吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組為（26.60±0.23）%，與正常對照組比較，缺氧組GBC-SD凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組GBC-SD凋亡率高于正常對照組和缺氧組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見圖1。

2.3 各組HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平比較

缺氧組GBC-SD的HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與正常對照組比較，吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P < 0.05）;與缺氧組比較，吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P < 0.05），吳茱萸堿能明顯抑制GBC-SD內(nèi)HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)。三組GBC-SD細(xì)胞的HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)帶及蛋白表達(dá)量。見圖2。

3 討論

缺氧是實(shí)體腫瘤生長過程中普遍存在的狀態(tài)，HIF-1α是腫瘤細(xì)胞在缺氧應(yīng)答中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[6]。由于缺氧的程度和時(shí)間不同，HIF-1α在缺氧組織細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了雙重作用。一方面，隨著腫瘤體積不斷增大，其生長的微環(huán)境中氧含量出現(xiàn)降低時(shí)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白的降解過程被抑制，導(dǎo)致其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)不斷積聚，進(jìn)而刺激腫瘤細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下血管生成，改善腫瘤生長微環(huán)境[7-8];另一方面，HIF-1α也能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，在缺氧狀態(tài)下，抑制凋亡蛋白數(shù)量減少，而促進(jìn)凋亡蛋白Bax及前凋亡蛋白BNIP3表達(dá)水平均增高，并與HIF-1α表達(dá)水平呈正相關(guān);此外野生型p53與HIF-1α的氧依賴ODD相互作用促進(jìn)缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[9]。

VEGF是目前已知的作用最強(qiáng)、特異性最高的腫瘤血管生成促進(jìn)因子，它也是HIF-1α的重要靶基因之一。VEGF能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制其凋亡，并且能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對放、化療產(chǎn)生耐受。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的HIF-1α不僅可與VEGF 5′-末端增強(qiáng)子相互作用，促進(jìn)VEGF基因表達(dá)上調(diào);還可增加VEGF mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)增加，從而調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，增加腫瘤的供氧能力[10-11]。在腫瘤的血管生成和生長侵襲過程中VEGF和HIF-1α兩者起著相互協(xié)同的作用。多項(xiàng)研究提示，通過抑制HIF-1α的表達(dá)使VEGF的表達(dá)下調(diào)，可減少腫瘤組織的血管生成，抑制腫瘤組織在缺氧微環(huán)境下的糖酵解，從而抑制腫瘤生長[12-14]。

研究顯示，膽囊癌組織中的HIF-1α、VEGF均為高表達(dá)狀態(tài)，二者的表達(dá)量不僅與膽囊癌組織中的微血管計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，也與患者的疾病進(jìn)展成明顯正相關(guān)[15-16]。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞的凋亡，推測可能是由于缺氧時(shí)間較短，HIF-1α介導(dǎo)的促凋亡作用強(qiáng)于抗凋亡作用。蛋白檢測結(jié)果顯示，無論是在常氧環(huán)境還是在缺氧微環(huán)境下，GBC-SD內(nèi)的HIF-1α和VEGF蛋白均有表達(dá)，但在缺氧的微環(huán)境下二者的表達(dá)要明顯增強(qiáng)。GBC-SD內(nèi)的HIF-1α在缺氧微環(huán)境的刺激下表達(dá)上調(diào)，并誘導(dǎo)其下游靶基因VEGF的表達(dá)增強(qiáng)。

吳茱萸堿是中藥吳茱萸的有效成分，具有抗腫瘤作用[17]。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，吳茱萸堿能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長、促進(jìn)其凋亡，并能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[18-20]。吳茱萸堿可通過抑制HIF-1α使VEGF的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致過度增殖的腫瘤細(xì)胞無法適應(yīng)缺氧微環(huán)境，達(dá)到抑制腫瘤增殖的效果[21]。此外，吳茱萸堿還可通過抑制缺氧狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[22-23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在缺氧微環(huán)境下，吳茱萸堿能夠抑制GBC-SD的增殖，同時(shí)促進(jìn)其凋亡。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，吳茱萸堿能夠明顯抑制GBC-SD的HIF-1α及VEGF蛋白的表達(dá)。由此，本研究認(rèn)為在缺氧微環(huán)境下，通過抑制HIF-1α及其靶基因VEGF的表達(dá)可抑制GBC-SD增殖并促進(jìn)其凋亡。因此，抑制腫瘤細(xì)胞HIF-1α及其靶基因VEGF的過表達(dá)，對于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡有著十分重要的意義，這為抑制腫瘤生長帶來了新的思路。

綜上所述，吳茱萸堿能夠抑制缺氧微環(huán)境下GBC-SD的HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)，使其無法適應(yīng)缺氧微環(huán)境，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，這為膽囊癌的治療提供了新方向。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? 阮戈.膽囊癌患者HIF-1α在膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究[J].中國普通外科雜志，2012，21（8）：1004-1006.

[2]? Hundal R，Shaffer EA. Gallbladder cancer：epidemiology and outcome [J]. Clin Epidemiology，2014，6（1）：99-109.

[3]? 孫學(xué)軍，石景森，王林，等.原發(fā)性膽囊癌診治分析（附1222例報(bào)告）[J].中國實(shí)用外科雜志，2014，34（2）：179-182.

[4]? 張志仙，蔣美玲，王欣慧，等.吳茱萸堿的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，14（21）：4189-4191.

[5]? 張慶然，周昭伶，潘振海，等.吳茱萸堿抑制Huh7細(xì)胞生長并增強(qiáng)細(xì)胞對TRAIL的敏感性[J].中國病理生理雜志，2018，34（2）：212-217.

[6]? Jun JC，Rathore A，Younas H，et al. Hypoxia-Inducible Factors and Cancer [J]. Curr Sleep Medicine Rep，2017，3（1）：1-10.

[7]? 秦一雨，王健東，全志偉.膽囊癌血管生成的研究進(jìn)展[J/CD].中華肝臟外科手術(shù)學(xué)電子雜志，2016，5（1）：56-58.

[8]? Schito L. Hypoxia-Dependent Angiogenesis and Lymphangiogenesis in Cancer [J]. Adv Exp Med Biol，2019，1136：71-85.

[9]? 杜靜，孫保存，劉易欣.缺氧誘導(dǎo)因子-1α在腫瘤學(xué)中的研究進(jìn)展[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2013，29（5）：548-551.

[10]? May D，Itin A，Gal O，et al. Ero1-L alpha plays a key role in a HIF-1-mediated pathway to improve disulfide bond formation and VEGF secretion under hypoxia：implication for cancer [J]. Onco-gene，2005，24（6）：1011-1020.

[11]? Liu K，Xu LM，Peng J，et al. The Changes of HIF-1α and VEGF Expression After TACE in Patients With Hepatocellular Carcinoma [J]. J Clin Med Res，2016，8（4）：297-302.

[12]? Jayant D，Sonal S，Sakshi M，et al. Salinomycin inhibits breast cancer progression via targeting HIF-1α/VEGF mediated tumor angiogenesis in vitro and in vivo [J]. Biochem Pharmacol，2019，164：326-335.

[13]? Tian QG， Wu YT，Liu Y，et al. Expressions and correlation analysis of HIF-1α，survivinand VEGF in patients with hepatocarcinoma [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2018，22（11）：3378-3385.

[14]? Zhou F，Du J，Wang JJ. Albendazole inhibits HIF-1α-dependent glycolysis and VEGF expression in non-small cell lung cancer cells [J]. Mol Cell Biochem，2017，428（1/2）：171-179.

[15]? Lin W，Jiang L，Chen Y，et al. Vascular endothelial growth factor-D promotes growth，lymphangiogenesis and lymphatic metastasis in gallbladder cancer [J]. Cancer Lett，2012，314（2）：127-136.

[16]? Xu DQ，Li JW，Jiang FF，et al. The Effect and Mechanism of Vascular Endothelial Growth Factor （VEGF） on Tumor Angiogenesis in Gallbladder Carcinoma [J]. Iran J Public Health，2019，48（4）：713-721.

[17]? Hu X，Li DH，Chu C，et al. Antiproliferative Effects of Alkaloid Evodiamine and Its Derivatives [J]. Int J Mol Sci，2018，19（11）：3403.

[18]? Ji YH，So HP，Hye YM，et al. Anti-Proliferative Effects of Evodiamine in Human Lung Cancer Cells [J]. J Cancer Prev，2014，19（1）：7-13.

[19]? Zhou P，Li XP，Jiang R，et al. Evodiamine inhibits migration and invasion by Sirt1-mediated post-translational modulations in colorectal cancer [J]. Anticancer Drugs，2019，30（6）：611-617.

[20]? Shen HM，Zhao S，Xu ZP，et al. Evodiamine inhibits proliferation and induces apoptosis in gastric cancer cells [J]. Oncology letters，2015，10（1）：367-371.

[21]? Huang J，Chen ZH，Ren CM，et al. Antiproliferation effect of evodiamine in human colon cancer cells is associated with IGF-1/HIF-1αdown regulation [J]. Oncol Rep，2015，34（6）：3203-3211.

[22]? Li YL，Zhang NY，Hu X，et al. Evodiamine induces apoptosis and promotes hepatocellular carcinoma cell death induced by vorinostat via downregulating HIF-1α under hypoxia [J]. Biochem Biophys Res Commun，2018，498（3）：481-486.

[23]? 袁志堅(jiān)，何文涓，胡晶.吳茱萸次堿藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2018，15（36）：40-43.

（收稿日期：2019-12-16? 本文編輯：封? ?華）