陳華 周迪夷

[摘要] 目的 探討何首烏提取物對單側(cè)腎切除聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病腎?。―N）大鼠的影響。 方法60只SPF級雄性Wistar大鼠成功造模后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組，模型組，厄貝沙坦組，二苯乙烯苷（TSG）低、中、高劑量組，每組10只。各組大鼠每日灌服相應(yīng)劑量的藥物，對照組和模型組每日灌服相應(yīng)體積的蒸餾水。記錄并分析各組小鼠的各項指標(biāo)。 結(jié)果 與對照組比較，模型組體重、核因子（NF）-κB抑制蛋白（IκBα）表達(dá)量顯著降低，腎指數(shù)，血清肌酐（Scr）、尿素氮（UN）水平，24 h尿蛋白含量，白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）水平及mRNA表達(dá)，Toll樣受體4（TLR4）、NF-κB p65及磷酸化（p）-IκBα蛋白表達(dá)量顯著升高，腎小球受損程度較重，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。與模型組比較，各實驗組體重明顯升高，Scr、UN水平，24 h尿蛋白含量，IL-1β、IL-6、MCP-1水平，TLR4、NF-κB p65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平明顯下降，腎小球受損程度明顯好轉(zhuǎn)，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 TSG可能通過下調(diào)TLR4/NF-κB信號通路抑制炎性因子的生成，從而保護(hù)DN大鼠的腎臟組織。

[關(guān)鍵詞] 何首烏;糖尿病腎病;Toll樣受體4/核因子-κB;影響

[中圖分類號] R587.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（b）-0021-05

Effect of tetrahydroxystilbene glucoside of Polygonum multiflorum extract on early diabetic nephropathy rats based on TLR4/NF-κB signaling pathway

CHEN Hua1? ?ZHOU Diyi2

1.Department of Chinese Medicine， Hangzhou Lin′an Traditional Chinese Medicine Hospital， Zhejiang Province， Hangzhou? ?310000， China; 2.Department of Endocrinology， Zhejiang Integrated Traditional and Western Medicine Hospital， Zhejiang Province， Hangzhou? ?310000， China

[Abstract] Objective To explore the effect of Polygonum multiflorum extract on unilateral nephrectomy combined with streptozotocin （STZ）-induced diabetic nephropathy （DN） rats. Methods A total of 60 SPF male Wistar rats were successfully modeled， while divided into control group， model group， irbesartan group， tetrahydroxystilbene glucoside （TSG） low， medium and high dose groups， with 10 rats in each group. Rats were given the corresponding dose of drugs daily， while the control and the model group were infused with a corresponding volume of distilled water. Indexes of rats in each group were recorded and analyzed. Results Compared with the control group， body weight and nuclear factor （NF）-κB inhibition（IκBα） protein expression were reduced in the model group， renal index， the level of serum creatinine （Scr）， urea nitrogen （UN）， 24 h urine protein content， the levels and mRNA expression of interleukin （IL） -1β， IL-6 and monocyte chemoattractant protein 1（MCP-1）， and the protein expression of Toll-like receptor 4 （TLR4）， NF-κB p65 and phosphorylated （p）-IκBα were significantly increased， while? the glomerular damage was severe， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the model group， the weight of each experimental group was significantly increased， the levels of Scr， UN， 24 h urine protein content， IL-1β， IL-6， MCP-1， the protein expression of TLR4， NF-κB p65 and p-IκBα were significantly decreased， while the degree of glomerular damage was significantly improved， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion TSG may inhibit the formation of inflammatory factors by down-regulating TLR4/NF-κB signaling pathway to protect the kidney tissue of DN rats.

[Key words] Polygonum multiflorum; Diabetic nephropathy; Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB; Effect

糖尿病是一種復(fù)雜代謝性疾病，2013年我國糖尿病患病人數(shù)居全球首位[1]。糖尿病腎病（DN）是糖尿病的主要微血管病變，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，越來越多的證據(jù)顯示[2-3]，炎癥過程能加速DN發(fā)展。對于DN的治療，目前主要是在控制患者血糖的同時使用藥物調(diào)節(jié)血脂及抗氧化。然而，該方法療效并不顯著[4]。二苯乙烯苷（TSG）是何首烏的有效成分之一，具有抗炎、抗衰老、降血脂等功能[5]。前期研究顯示[6]，TSG對DN具有一定的療效，然而，具體機(jī)制仍然未知。本研究主要基于Toll樣受體4（TLR4）/核因子（NF）-κB信號通路探討TSG對DN大鼠的作用和機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)利用TSG提供基礎(chǔ)的思路和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SPF級雄性Wistar大鼠，體重（150±20）g，1.4月齡，購自重慶市騰鑫生物技術(shù)有限公司，合格證號：SYXK（渝）2017-0006。浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)動物實驗。

1.2 試劑

鏈脲佐菌素[生工生物工程（上海）有限公司，A61 0130-0100];TSG（中國藥品生物制品檢定所，批號：0844-200003）;厄貝沙坦（浙江華海藥業(yè)股份有限公司，批號：H20000505）;白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號：JYM0419Ra、JYM0646Ra、JYM0495Ra）;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（萬類生物科技有限公司，批號：20170805）;Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛世爾生物科技有限公司，批號：12183555、N8080234）;TLR4、NF-κB p65及β-actin抗體（北京博奧森生物技術(shù)公司，批號：bs-20594R、bs-23217R、bs-0061R）;磷酸化NF-κB抑制蛋白（p-IκBα）、IκBα抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：AF5851、AF5204）。

1.3 儀器

血糖儀（樂康全）;全自動生化分析儀檢（日立7020）;生物顯微鏡（奧林巴斯CX23）。

1.4 方法

1.4.1 糖尿病腎病模型的建立? 對所有大鼠進(jìn)行左腎切除術(shù)。術(shù)后2周，按40 mg/kg腹腔內(nèi)注射鏈尿佐菌素（STZ），STZ臨用前用0.1 mmol/L的枸櫞酸緩沖液（pH 4.4）配成濃度為2%溶液。對照組腹腔內(nèi)注入等量枸椽酸緩沖液。72 h后，尾靜脈采血測量血糖，連續(xù)3次血糖≥16.7 mmol/L提示造模成功[7]。

1.4.2 動物分組及處理? 按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成對照組、模型組、厄貝沙坦組、TSG低、中、高劑量組。TSG低、中、高劑量組每日分別灌服TSG 10、20、30 mg/kg;厄貝沙坦組每日灌服厄貝沙坦50 mg/kg;模型組和對照組每日灌服相應(yīng)體積的蒸餾水。實驗周期為8周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般情況? 大鼠的活動、精神、毛色、食欲、排便、最后一次給藥后的體重、右側(cè)腎臟重量、腎指數(shù)[腎指數(shù)（%）=腎質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）]等。

1.5.2 腎功能指標(biāo)? 用全自動生化分析儀測定24 h尿蛋白、血清肌酐（Scr）及尿素氮（UN）水平。

1.5.3 炎性因子水平? 按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行IL-1β、IL-6和MCP-1含量的檢測。

1.5.4 HE染色? 對腎臟組織進(jìn)行HE染色，在生物顯微鏡下觀察并分析各組大鼠腎臟組織的病理學(xué)變化。

1.5.5 RT-PCR檢測? 取腎皮質(zhì)約100 mg，用Trizol試劑盒提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。各目的基因引物均由上海生工合成，其序列分別為（3′-5′）：①IL-1β：上游TACCTGAGCTCGCCAGTGAA，下游TTTGGTCCCTCCCAGGAAGA;②IL-6：上游TG-AACTCCTTCTCCACAAGCG，下游ATTTGTGGTTGG-GTCAGGGG;③MCP-1：上游AGATCTGTGCTGACCC-CAAG，下游TCTTCGGAGTTTGGGTTTGCT;④內(nèi)參GADPH：上游ATTCCACCCATGGCAAATTCC，下游GACTCCACGACGTACTCAGC。取聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳分離。用凝膠成像系統(tǒng)分析成像，結(jié)果用目的基因片斷和內(nèi)參片斷的條帶光密度比值表示。

1.5.6 Western blot分析? 取部分腎組織，用BCA法定量。取總蛋白，對其進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜及封閉，然后加入相應(yīng)一抗，4℃下孵育過夜，然后加入相應(yīng)二抗，孵育2 h后，化學(xué)發(fā)光，照相。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析;進(jìn)一步兩兩比較，采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為有差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重與腎指數(shù)情況比較

與對照組比較，模型組大鼠活動度低，精神萎靡，毛色枯黃，出現(xiàn)弓背、進(jìn)食量減少、多飲、多尿等現(xiàn)象;體重明顯下降，腎指數(shù)明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。與模型組比較，TSG各劑量組大鼠體重明顯增加，TSG高劑量組大鼠腎指數(shù)顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖1。

2.2 各組大鼠Scr、UN及24 h尿蛋白含量比較

與對照組比較，模型組Scr、UN及24 h尿蛋白含量均明顯上升，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。與模型組比較，各實驗組大鼠Scr水平明顯降低;除TSG低劑量組外，其他各實驗組UN及24 h尿蛋白含量均明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖2。

2.3 各組大鼠腎臟組織中IL-1β、IL-6及MCP-1水平比較

與對照組比較，模型組腎臟組織中IL-1β、IL-6及MCP-1水平明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。與模型組比較，各實驗組大鼠腎臟組織中IL-1β、IL-6及MCP-1水平明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖3。

2.4 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)結(jié)果比較

與對照組比較，模型組腎小球出現(xiàn)較多的空泡，包曼氏囊腔呈現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，且有炎癥浸潤現(xiàn)象。與模型組比較，各實驗組大鼠腎小球受損程度有所緩解，空泡較少，包曼氏囊腔皺縮程度較輕。見圖4。

2.5 各組大鼠腎臟組織中IL-1β、IL-6及MCP-1 mRNA表達(dá)水平比較

與對照組比較，模型組腎臟組織中IL-1β、IL-6及MCP-1 mRNA表達(dá)量顯著增加（P < 0.01）。與模型組比較，除TSG低劑量組外，其他各實驗組IL-1β mRNA水平顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。厄貝沙坦組及TSG高劑量組IL-6、MCP-1 mRNA水平顯著低于模型組，TSG低劑量組IL-6 mRNA水平顯著高于模型組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖5。

2.6 各組大鼠腎臟組織中各蛋白表達(dá)比較

與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中Toll樣受體4（TLR4）、核因子（NF）-κB p65和磷酸化NF-κB抑制蛋白（p-IκBα）表達(dá)量顯著上升，NF-κB抑制蛋白（IκBα）表達(dá)量顯著下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。與模型組比較，各實驗組大鼠腎臟組織中TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。除TSG低劑量組外，其他各實驗組p-IκBα水平顯著低于模型組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。模型組與各實驗組大鼠IκBα蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖6。

3 討論

何首烏是種多年生纏繞藤本植物，其塊根可入藥，具有解毒、消炎等功效[8]。研究顯示[9-10]，何首烏復(fù)方制劑對糖尿病及其并發(fā)癥有較好的作用。TSG是何首烏的有效成分之一，有抗炎、抗衰老、降血脂等功能[11]。李彩蓉等[12]研究顯示，TSG可憑借其強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激能力來抑制炎性因子的表達(dá)。楊宇虹等[13]發(fā)現(xiàn)TSG可通過抑制Kupffer細(xì)胞的激活來減少炎癥因子的表達(dá)。本研究顯示，TSG可改善DN大鼠的一般情況，降低DN大鼠Scr、UN、24 h尿蛋白含量及炎性因子IL-1β，IL-6及MCP-1的表達(dá)。

TLRs是天然免疫系統(tǒng)中一類保守的模式識別受體，在外源微生物病原體的作用下可激活下游炎癥信號通路[14-15]。在所有TLRs中，TLR4與急性腎損傷、慢性腎臟疾病和DN的發(fā)生密切相關(guān)[16]。NF-κB是TLR4信號通路的下游效應(yīng)因子，可介導(dǎo)多種炎癥過程[17-19]。研究顯示[20]，活化TLRs信號可激活NF-κB活性，從而增加炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，進(jìn)而引起局部炎癥。Mudaliar[21]認(rèn)為，TLR4信號通路會影響炎癥的發(fā)生，阻斷其信號通路可治療DN。本研究結(jié)果顯示，TSG可有效抑制IκBα磷酸化，減少DN大鼠腎臟組織中的TLR4、NF-κB p65的表達(dá)量，降低炎性因子IL-1β、IL-6及MCP-1的表達(dá)，改善DN大鼠的病理變化，提示TSG可能通過下調(diào)TLR4/NF-κB信號通路，抑制炎性因子IL-1β、IL-6及MCP-1的生成，從而保護(hù)DN大鼠的腎功能。

綜上所述，何首烏提取物TSG對DN大鼠的腎臟組織具有保護(hù)作用，內(nèi)在機(jī)制可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，為進(jìn)一步利用何首烏提取物TSG治療DN提供了理論依據(jù)。

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（收稿日期：2019-10-23? 本文編輯：王曉曄）