魏 婷， 孫燕妮， 李 鮮

(陜西科技大學 環(huán)境科學與工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

鎘(Cadmium，Cd)是自然界中存在的一種重金屬微量元素，也是公認的致癌、致畸、致突變物質(zhì)，具有很強的生物毒性.Cd礦的開采、含Cd廢棄物的不合理的排放及農(nóng)業(yè)化學品的不合理使用，導致我國農(nóng)田土壤Cd累積和超標問題日益突出[1,2].土壤中的Cd可通過質(zhì)外體或共質(zhì)體途徑進入植物體內(nèi)[3]，造成農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降，同時，Cd可以通過食物鏈進入人體從而引發(fā)嚴重的健康問題.因此，有效地治理和安全利用Cd污染土壤對于保障農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)和人體健康具有重要意義.

傳統(tǒng)的物理、化學方法修復重金屬污染土壤成本高，且容易造成土壤結構破壞并給環(huán)境帶來二次污染，不宜大面積推廣.近年的研究發(fā)現(xiàn)，重金屬污染土壤中的根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)與植物根系以及土壤形成特殊根際微環(huán)境，影響植物重金屬吸收、轉運過程及對重金屬的抗性[4,5].因此，PGPR誘導植物解毒系統(tǒng)來對抗重金屬脅迫逐漸成為了研究的熱點.PGPR能夠通過其自身代謝活動來提高根際土壤中重金屬元素的生物有效性,還可通過分泌植物生長激素吲哚-3-乙酸(IAA)、鐵載體以及促進植物對礦物元素(磷)吸收來促進種子萌發(fā)，提高葉綠素含量，增強光合效率，促進了植物的生長，間接提高植物對重金屬的抗性[6].與此同時，PGPR還可以通過影響植物細胞生理活動，激活植物抗氧化酶活性，誘導植物系統(tǒng)抗性，調(diào)控植物重金屬的吸收、轉運相關基因表達，來減輕重金屬對植物的毒害作用[7].接種植物促生菌Bradyrhizobiumsp.750能夠緩解重金屬對于黃羽扇豆的毒害作用，顯著增加其生物量，并降低根系重金屬(Cd、Pb、Zn和Cu)含量與地上部植物組織重金屬(Cd和Pb)含量[8].接種Klebsiellasp.CIK-502 能夠增加重金屬脅迫下小麥和玉米的生物量，同時顯著降低地上部與地下部Cd含量[9].接種耐Cu的根際促生菌可以緩釋Cu對扁豆的氧化脅迫，同時降低植物體對Cu的吸收[10].

綜上，植物根際促生菌在植物重金屬逆境的響應中扮演著重要角色，在促進植物生長和提高重金屬抗性的同時，可以調(diào)控植物對重金屬的吸收、轉運以及累積，因此，本研究從受Cd污染的設施菜地番茄根際土壤中分離到了一株Cd抗性的根際促生菌，對其促生性能，以及對番茄幼苗生長和Cd累積的影響進行了研究，以期為采用環(huán)境友好的根際植物促生菌調(diào)控作物重金屬吸收轉運，降低作物可食部分重金屬累積，實現(xiàn)中低污染農(nóng)田安全生產(chǎn)提供新的研究思路與理論支持.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

1.1.1 土壤樣品的收集

土壤樣品來自于西安市郊Cd污染的設施菜地番茄根際土壤，將番茄連根拔起，輕輕抖動去除非根際土，用小刷子刷取植物樣品根際土，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，用ddH2O溶解并定容至1 L.LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加瓊脂粉20 g/L;無機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、Ca3(PO4)25 g、MgCl2·6H2O 5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、KCl 0.2 g、(NH4)2SO40.1 g、蒸餾水1 000 mL，pH6.8～7.0;MKB培養(yǎng)基：酪蛋白氨基酸5.0 g、甘油15 mL、K2HPO42.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、純水1 000 mL,pH7.2.

1.1.3 供試番茄種子

番茄種子(石紅3號)購自于新疆石河子蔬菜研究所.

1.2 實驗方法

1.2.1 根際促生菌的分離

取0.1 g根際土加入含有1 mL無菌水的滅菌離心管中，充分混勻并逐級稀釋，分別從濃度為10-4、10-5、10-6的稀釋液中取0.1 mL的菌懸液涂布在LB平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h.從平板上挑取不同形態(tài)的單菌落純化后用接菌環(huán)依次挑至Cd濃度為200 mg/L、300 mg/L和400 mg/L的LB平板上，選擇耐Cd能力強、生長速度快的菌株轉至LB斜面培養(yǎng)基4 ℃條件下保藏備用.

1.2.2 根際耐Cd促生菌的促生性能測定

產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)能力的測定：5 mg/mL色氨酸母液經(jīng)0.22μm過濾除菌后備用.取1 mL懸浮菌液(108CFU/mL)接種于100 mL含色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，對照組加入1 mL LB培養(yǎng)基，于29 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)48 h，離心取1 mL上清液與2 mL Salkowski試劑(150 mL濃H2SO4、250 mL蒸餾水、7.5 mL 0.5 mol/L FeCl3·6H2O)充分混合，將混合物在室溫下溫育20 min，在535 nm處測量吸光度，然后通過標準曲線確定IAA含量[11].

溶磷性能測定：取1 mL懸浮菌液(108CFU/mL)接種于50 mL滅菌的無機磷液體培養(yǎng)基中，29 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)5天，8 000 r/min下離心10 min，取上清液采用鉬銻比色法測定有效磷含量[12].

產(chǎn)鐵載體能力的測定：根據(jù)孫磊等[13]的方法測定.取1 mL懸浮菌液(108CFU/mL)接種于50 mL經(jīng)滅菌的MKB培養(yǎng)基中，29 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)5天，離心取上清液加入等體積的CAS檢測液，靜置1 h后測定OD630(A)，未接菌的MKB培養(yǎng)基OD630(Ar)，A/Ar值在0～0.6表示產(chǎn)鐵載體能力較強，在 0.6～0.8表示產(chǎn)鐵載體能力中等，在0.8～1之間表示較弱.根據(jù)公式(1)計算菌產(chǎn)鐵載體量：

鐵載體活性(%)=[(Ar-A)/Ar]*100%

(1)

1.2.3 菌株的分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

采用細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取供試菌株的總DNA.用細菌通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 進行16S rDNA基因的擴增，將 PCR 擴增產(chǎn)物送上海生工進行測序.所得序列與GenBank中相關序列進行同源性比對，利用MEGA7.0中的Neighbor-joining analysis構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.4 水培實驗

番茄種子用10%次氯酸鈉消毒并均勻播種于蛭石中，置于自動控制生長室中(16 h 光照/8 h黑暗條件、溫度 26 ℃/20 ℃、相對濕度 75%).待其長至兩葉一心期轉至Hoagland營養(yǎng)液中并定期換營養(yǎng)液，培養(yǎng)三周后選取長勢一致的幼苗進行接菌處理.將分離得到的Cd抗性菌株D36在LB液體培養(yǎng)基中進行活化，并于28 ℃培養(yǎng)18 h后離心，將得到的菌體用無菌水重懸至OD600=1.0時即得到待處理菌液.將需要接菌處理番茄幼苗根部浸泡于D36菌懸液中2 h，未接菌的用去離子浸泡作為對照.3天后對番茄幼苗進行2 mg/L的Cd(CdCl2·2.5H2O)處理.本研究共包括四個處理組：CK、Cd、D36、D36+Cd，每個處理24株苗子.在Cd處理7天后收樣,整個實驗重復三次.

1.2.5 根長株高與鮮重的測定

用直尺測量番茄植株的根長與株高，用去離子水沖去根部殘留營養(yǎng)液，并用濾紙吸干水分，用天平稱取番茄各器官的鮮重.

1.2.6 葉綠素含量的測定

取0.2 g新鮮番茄葉片，加入10 mL體積分數(shù)為95%的乙醇避光研磨成勻漿并過濾，用酶標儀測定在波長665 nm、649 nm和470 nm的吸光度，以80%乙醇為空白調(diào)零.再計算出葉綠素a和葉綠素b的含量[14].

1.2.7 H2O2含量及過氧化物酶(POD)活性測定

H2O2含量的測定使用H2O2含量檢測試劑盒進行(上海索萊寶生物科技有限公司).POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[15].

1.2.8 Cd含量的測定

分開收集番茄幼苗的地上部與地下部，根部在5.0 mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)溶液中解析15 min，去除根表面吸附的Cd，然后用去離子水沖洗數(shù)次，并將地上部與地下部烘干稱重進行消解，最后使用原子吸收光譜儀進行Cd含量的測定[16].

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

本實驗采用Excel 2010統(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0進行單因素方差分析和多重比較(p<0.05)，用Origin Pro 8軟件進行繪圖，所有數(shù)據(jù)均為三次實驗平均值.

2 結果與討論

2.1 耐Cd促生菌的分離及分子生物學鑒定

從番茄根際土壤中篩選出38株根際耐Cd促生菌，其中菌株D36對Cd的耐受性最高，可以在Cd濃度為400 mg/L的LB平板上生長，且生長速度相對較快.故選用該菌株進行后續(xù)實驗.NCBI BLAST分析表明，菌株D36與鞘安醇單孢菌(Sphingomonassp.)的16S rDNA序列相似度達到99%.對菌株D36的16S rDNA序列用MEGA7.0分析軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖1所示.結果表明，番茄根際耐Cd促生菌D36為鞘安醇單孢菌(Sphingomonassp.)，該菌株的GenBank登錄號為MN540917.

圖1 根際耐Cd促生菌D36的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株D36溶磷、產(chǎn)IAA和產(chǎn)鐵載體能力

吲哚乙酸(IAA)是植物體中普遍存在的生長素類物質(zhì)，能促進植物細胞的伸長和細胞分裂，低水平的IAA能促進植物初生根的伸長，高濃度則可促進次生根和不定根的伸長.本研究表明，菌株D36能產(chǎn)生4.19±0.29 mg/L的IAA，其產(chǎn)IAA的能力較強，說明D36具有潛在的促生根系生長的能力.促生菌可以通過分泌低分子有機酸，降低pH使難溶磷或不溶磷轉換為植物易于吸收的有效態(tài)磷，由表1可知，D36溶磷能力為21.72±1.03 mg/L，具有促進植物磷元素吸收的性能.此外，PGPR能分泌一些與鐵具有較高親和力的嗜鐵素，從而結合鐵元素供植物生長[17].由表1可知，D36的產(chǎn)鐵載體活性在0～0.6之間，產(chǎn)鐵載體能力較強，故D36能通過較強的產(chǎn)鐵載體能力螯合鐵元素促進植物生長.綜上所述，D36具有潛在的促生能力.

表1 菌株D36溶磷、產(chǎn)IAA和產(chǎn)鐵載體能力

2.3 接種D36對Cd脅迫下番茄根長株高的影響

重金屬脅迫通常能夠抑制植物根尖細胞分裂或根的伸長[18].如圖2所示，Cd處理組番茄的根長與株高顯著低于CK對照組(p<0.05)，分別降低了37.09%和17.55%，表明2 mg/L的Cd脅迫會抑制番茄幼苗的生長.D36處理組的根長與株高顯著高于CK，分別增加了112.30%和16.53%.D36+Cd處理組的根長與株高與Cd處理組相比分別增加了210.74%和14.94%，說明接種D36菌株能顯著緩解Cd脅迫引起的番茄生長抑制.其原因可能是D36通過產(chǎn)生IAA促進植物根系生長發(fā)育，IAA是一種重要的促進植物細胞分裂的物質(zhì)，會促進植株根的伸長以加強營養(yǎng)元素的吸收，同時促進莖的伸長和形成維管組織.此外，D36通過溶磷和產(chǎn)鐵載體增加了根系對水分與養(yǎng)分的吸收從而緩解Cd脅迫對番茄幼苗生長的抑制[19],這一結果與Asghar等[20]的結果一致.有研究表明，PGPR可增加山豆根組培的新根數(shù)，誘導根部形成多個根尖，使根系變粗壯，這不僅有利于植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，也利于提高有益微生物對根部的浸染率[21].

圖2 不同處理對番茄根長與株高的影響

2.4 接種D36對Cd脅迫下番茄鮮重的影響

已有研究表明，有益的微生物-植物相互作用可以緩解重金屬脅迫導致的植物生長抑制[22].如圖3所示，Cd脅迫使得番茄地下部與地上部的鮮重分別降低了23.85%和42.19%，說明Cd處理會抑制番茄的生長發(fā)育，從而降低番茄植株的鮮重.D36+Cd處理組番茄地下部與地上部均顯著高于Cd處理組，分別增加了15.09%和18.33%，說明D36通過產(chǎn)生生長激素和分泌鐵載體以及溶解無機鹽的方式促進了養(yǎng)分吸收進而促進了番茄幼苗的生長，使其鮮重增加，從而緩解了Cd脅迫對番茄生長的抑制.

圖3 不同處理對番茄鮮重的影響

2.5 接種D36對Cd脅迫下番茄葉綠素含量的影響

重金屬能通過破壞光合作用中的電子傳遞和葉綠素完整性影響植物光合作用，許多植物在重金屬脅迫下都出現(xiàn)了葉片失綠的現(xiàn)象，有研究表明，在Cd脅迫下根際促生菌可提高葉綠素含量，減少Cd對植物光合作用的影響[23].

如圖4所示，與CK相比，Cd處理組的番茄葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量分別下降了7.76%、9.03%和8.41%，說明Cd抑制了番茄幼苗葉綠素合成過程中一些關鍵酶的活性，使葉綠體的光合膜蛋白中心離子發(fā)生改變，從而導致了葉綠素含量降低[24]；與Cd處理組相比，D36+Cd處理組的番茄葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量分別提高了11.19%、13.53%和13.40%，說明在Cd脅迫下，D36菌株能顯著提高葉綠素濃度，可能是由于D36作為根際促生菌增加了葉綠素合成必需元素的吸收，從而增加了番茄的葉綠素含量.

圖4 不同處理對番茄葉綠素含量的影響

2.6 接種D36對Cd脅迫下番茄H2O2含量的影響

重金屬脅迫時，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，引起氧化脅迫和膜脂過氧化，最終導致代謝失衡和對植物造成毒害.H2O2是植物體內(nèi)廣泛存在的活性氧自由基，能與生物大分子反應，從而破壞細胞結構與功能[25].

如圖5所示，Cd脅迫顯著提高了番茄根部的H2O2含量，而葉部H2O2含量在各處理組之間無顯著性差異(p<0.05).其原因在于Cd和D36均通過根部作用于植物，故根部的氧化脅迫水平差異較為顯著.與Cd處理組相比，D36+Cd處理使得番茄根部的H2O2含量降低了35.09%，說明接種D36菌株能顯著降低Cd脅迫下H2O2的含量，從而減少活性氧自由基對番茄幼苗細胞結構和功能的破壞.

圖5 不同處理對番茄H2O2含量的影響

2.7 接種D36對Cd脅迫下番茄過氧化物酶活性(POD)的影響

過氧化物酶(POD)可以將H2O2催化分解成H2O和O2，從而抵御H2O2對植物造成的毒害.如圖6所示，Cd脅迫下，番茄根部與葉部的POD活性分別提高了116.01%和164.65%，說明在Cd脅迫下植株啟動了防御機制來清除過量的H2O2，以抵御Cd脅迫造成的氧化損傷.與Cd處理組相比，D36+Cd處理組根部與葉部的POD活性分別增加了74.94%和3.81%，說明D36菌株可以通過提高番茄自身的POD活性來清除過量的H2O2，減少Cd對番茄的毒性.

圖6 不同處理對番茄幼苗POD活性的影響

2.8 接種D36對Cd脅迫下番茄Cd含量的影響

Cd雖不是植物的必須元素，但是可以通過質(zhì)外體和共質(zhì)體途徑進入植物體內(nèi)并在植物體內(nèi)累積.研究表明，PGPR能調(diào)節(jié)不同植物的重金屬吸收，且重金屬毒性與植物體內(nèi)重金屬濃度直接相關[26].

本研究測定了接種D36對番茄Cd含量的影響，結果如圖7所示，與Cd處理組相比，D36+Cd處理使得番茄根部的Cd含量降低了27.63%，地上部Cd含量無顯著性差異(p<0.05).說明D36菌株能通過顯著減少番茄地下部的Cd含量來緩解番茄的Cd毒害，從而減輕了Cd對番茄的氧化脅迫、生長抑制和對葉綠素合成的抑制.其原因可能是PGPR在一定條件下分泌的高分子聚合物，包括胞外多糖、蛋白質(zhì)和核酸等，富含負電官能團，具有優(yōu)越的金屬鍵合性，與土壤中的重金屬離子發(fā)生靜電吸附作用，從而限制了金屬離子的活動范圍[27]，同時，PGPR可通過調(diào)節(jié)細胞生理活動，誘導植物系統(tǒng)抗性，調(diào)控植物重金屬的吸收、轉運相關基因表達，從而調(diào)控植物體內(nèi)的重金屬濃度[7].

3 結論

本研究從Cd污染的番茄根際土壤中分離得到了D36菌株，經(jīng)16S rDNA分子生物學鑒定為鞘安醇單孢菌，該菌具有溶磷、產(chǎn)IAA和產(chǎn)鐵載體性能，并具有較高的Cd抗性.

水培實驗結果顯示，接種該菌顯著提高了番茄的根長、株高以及植株鮮重，有效緩解Cd脅迫對番茄生長的抑制.也顯著提高了番茄葉片中的葉綠素含量，降低了番茄根部的H2O2含量并提高POD活性，同時，接種D36有效降低番茄根部的Cd含量，從而提高番茄的Cd抗性，減輕Cd對番茄的毒害.該研究可以為采用環(huán)境友好型的植物根際促生菌調(diào)控作物Cd累積、緩解植物Cd脅迫提供理論依據(jù).