曾 橋， 呂生華， 李 祥， 李 卓， 吳雪艷， 蘇偉鵬， 王麗萍

(1.陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 3.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710021； 4.西安市食品藥品檢驗(yàn)所， 陜西 西安 710054)

0 引言

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，我國(guó)對(duì)肉制品的消費(fèi)量不斷增加，以豬肉、牛肉、羊肉和禽肉為代表的肉品產(chǎn)量逐年增長(zhǎng)，從而帶動(dòng)了畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展.目前，我國(guó)已成為世界上最大的畜禽養(yǎng)殖國(guó)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2018年全國(guó)豬牛羊禽肉產(chǎn)量已達(dá)8517萬(wàn)噸.不斷擴(kuò)大的畜禽養(yǎng)殖規(guī)模對(duì)環(huán)境造成了巨大的壓力，據(jù)估算，我國(guó)每年需要處理的養(yǎng)殖畜禽糞便在40億噸以上.獸用抗生素在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中主要用作抗菌劑和促生長(zhǎng)劑而直接添加到飼料中，然而，僅少部分抗生素參與體內(nèi)代謝，大部分以原藥的形式隨糞尿直接排出體外[1].由于我國(guó)畜禽糞便產(chǎn)量巨大，且大部分養(yǎng)殖場(chǎng)缺乏必要的糞污處理措施，大量的糞便被隨意處置而進(jìn)入農(nóng)田土壤和水環(huán)境中，不僅帶來(lái)了惡臭等生態(tài)環(huán)境污染，而且隨糞便排放到環(huán)境中的抗生素還會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而損害人體健康.

高溫堆肥是實(shí)現(xiàn)畜禽糞便無(wú)害化和資源化的有效途徑，通過(guò)堆肥一方面將糞便中的多種成分轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定和易于被植物吸收利用的養(yǎng)分，同時(shí)，堆肥還有助于畜禽糞便中有害成分的降解和去除.勾長(zhǎng)龍等[1]研究發(fā)現(xiàn)，高溫堆肥能顯著降低豬糞中四環(huán)素類(lèi)抗生素的含量，且對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗性基因有一定的消減作用.林輝等[2]研究結(jié)果表明，雞糞中磺胺藥在高溫堆肥14 d內(nèi)降解率達(dá)100%.因此，開(kāi)展對(duì)畜禽糞便以及畜禽糞便堆肥過(guò)程中基質(zhì)的多種殘留抗生素的檢測(cè)研究對(duì)于降低生態(tài)污染風(fēng)險(xiǎn)，保護(hù)環(huán)境具有重要意義.

高效液相色譜及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是目前抗生素檢測(cè)的主要方法[3,4]，此外，還有微生物法[5]、免疫分析技術(shù)(包括酶聯(lián)免疫[5,6]、膠體金免疫層析[7])以及電化學(xué)免疫傳感器[8,9]等)、可視化蛋白芯片分析技術(shù)[10]、高效毛細(xì)管電泳法[11]等.高效液相色譜作為常用方法，其檢測(cè)器對(duì)干擾物屏蔽效果不佳，為了達(dá)到理想結(jié)果，往往需要更高的前處理技術(shù)和色譜分離技術(shù).液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜較高效液相色譜法抗干擾能力強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)快速，定量和定性分析更準(zhǔn)確[12,13].樣品前處理是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)抗生素殘留的關(guān)鍵步驟，QuEChERS法具有前處理簡(jiǎn)單、較高的回收率、結(jié)果準(zhǔn)確、減少操作過(guò)程中人與有害溶劑的接觸等優(yōu)點(diǎn)[14]，目前已在食品抗生素殘留檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用，但用于檢測(cè)畜禽糞便中抗生素殘留的報(bào)道較少.

本文采用QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立畜禽糞便中多種殘留抗生素的定性定量測(cè)定方法，該方法準(zhǔn)確，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，具有良好的應(yīng)用前景和廣泛的應(yīng)用范圍.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸土霉素(≥ 98.75%)、鹽酸四環(huán)素(≥ 99.60%)、磺胺嘧啶(≥ 99.22%)、諾氟沙星(≥ 99.70%)，購(gòu)于上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；磺胺甲嘧啶(≥ 99.70%)、氧氟沙星(≥ 95.70%),購(gòu)于德國(guó)DR.E公司.

乙腈、甲醇,色譜純，F(xiàn)isher公司；乙二胺四乙酸二鈉(色譜級(jí))、甲酸、乙酸銨(質(zhì)譜級(jí)),上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；QuEChERS Cleanert LipoNo管,天津博納艾吉爾科技有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

Ulimate3000-TSQ Quantiva 超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；KH5200DE醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；Milli-Q Integral 5 純水機(jī)，密理博有限公司；ME204E 萬(wàn)分之一電子天平、MS105 十萬(wàn)分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；TL5R 離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；FD5-2.5 真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)SIM國(guó)際集團(tuán)有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取各抗生素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解，配制500μg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，-18 ℃保存.準(zhǔn)確量取鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液各1 mL，量取磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、氧氟沙星、諾氟沙星單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液各0.1 mL，共同置于10 mL棕色容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到濃度為50μg/mL(鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素)和5μg/mL(磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、氧氟沙星、諾氟沙星)的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，進(jìn)一步吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋得系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液.

1.3.2 供試品溶液的制備

新鮮豬糞取自西安周邊養(yǎng)殖場(chǎng)，經(jīng)冷凍干燥后研磨并混合均勻，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g干燥豬糞樣品，置于50 mL離心管中，加入0.1 mol/L EDTA-2Na溶液2 mL，渦旋1 min，繼續(xù)加入乙腈8 mL，渦旋1 min，超聲處理15 min后，于10 000 r/min離心10 min，取上清液3 mL加入Cleanert LipoNo凈化管中，振搖1 min后，靜置1 min，進(jìn)一步取0.1 mL上清液加2.9 mL水，渦旋1 min，稍靜置后取0.5 mL上清液加2 mL水，渦旋1 min，用0.22μm聚醚砜微孔濾膜濾過(guò)，置于進(jìn)樣瓶中，待分析.

?M.Sebastiano Erizzo.Discorso sopra le medaglie degli antichi：con la dichi aratione delle monete consulari e delle medaglie degli Imperadori Romani,Venice (Varisco&Paganini),1559;Trattato di messer Sebastiano Erizzo,dell'istrumento et via inventeur de gli antichi,Venice,1554.

1.3.3 色譜-質(zhì)譜條件

(1)色譜條件

色譜柱：Thermo Fisher Scientific C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9μm)；流動(dòng)相A：0.1%甲酸-10 mmol/L甲酸銨水溶液(V/V)；流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈(V/V)；梯度洗脫程序：0～1.0 min，5% B、1.0～1.1 min，5%～15% B、1.1～9.5 min，15%～75% B、9.5～9.6min，75% ～95% B、9.6～11.5 min，95% B、11.5～11.6 min，95%～5% B、11.5～11.6 min，5% B、流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2μL.

(2)質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；霧化氣：N2(≥ 99.9%)；碰撞氣：Ar(≥ 99.99%)；霧化溫度：300 ℃ ；離子傳輸管溫度：350 ℃ ；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；鞘氣流速：5 L/min；輔助氣流速：8 L/min.各目標(biāo)抗生素保留時(shí)間、離子對(duì)、碰撞能量、傳輸電壓等質(zhì)譜條件見(jiàn)表1所示.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

配制6種目標(biāo)抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以在線流動(dòng)注射方式進(jìn)樣，分別采用正負(fù)離子掃描模式進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下進(jìn)行檢測(cè)時(shí)[M+H]+峰響應(yīng)強(qiáng)度大且穩(wěn)定.給予母離子不同碰撞能量，對(duì)子離子進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)響應(yīng)強(qiáng)度選擇定量和定性離子[15].優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1.

2.2 流動(dòng)相的選擇

配制適當(dāng)濃度6種目標(biāo)抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別考察0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈、含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸乙腈和水-乙腈3種流動(dòng)相體系對(duì)6種目標(biāo)抗生素的分離效果及質(zhì)譜響應(yīng)情況.結(jié)果表明，在正離子模式下，采用含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸乙腈作為流動(dòng)相，峰型良好，保留時(shí)間穩(wěn)定，質(zhì)譜相應(yīng)強(qiáng)度較另兩種流動(dòng)相體系大.因此，選擇含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸乙腈作為流動(dòng)相，在該條件下，6種目標(biāo)抗生素提取離子流圖見(jiàn)圖1所示.

(a)鹽酸土霉素

(b)鹽酸四環(huán)素

(c)磺胺嘧啶

(d)磺胺甲嘧啶

(e)氧氟沙星

(f)諾氟沙星圖1 各目標(biāo)抗生素提取離子流圖

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性相關(guān)性、檢測(cè)下限和定量下限

取“1.2”節(jié)中系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按“1.3.3”節(jié)中規(guī)定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以各抗生素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，確定相關(guān)系數(shù)(R2)，以信噪比S/N≥3 和S/N≥10 確定檢測(cè)下限(LOD)和定量下限(LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表2所示.從表2可以看出，6種目標(biāo)抗生素在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2在0.995 9～0.999 4之間.

表2 6種目標(biāo)抗生素線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)下限、定量下限

2.3.2 精密度試驗(yàn)

連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、氧氟沙星、諾氟沙星保留時(shí)間和峰面積的RSD(n=6)，結(jié)果見(jiàn)表3所示，精密度良好，符合測(cè)定要求.

表3 精密度試驗(yàn)

2.3.3 回收率和精密度

精密稱(chēng)取空白豬糞樣品，分別在各抗生素低、中、高三個(gè)水平下進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)，按“1.3.2”節(jié)中要求進(jìn)行處理后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各目標(biāo)抗生素回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表4所示.6種目標(biāo)抗生素平均回收率在69.7%～119.2%，相對(duì)偏差為0.7%～10.0%(n=6)，說(shuō)明方法回收率和精密度良好，能滿足豬糞中抗生素殘留的測(cè)定要求.

表4 6種目標(biāo)抗生素回收率和精密度

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取豬糞抗生素陽(yáng)性樣品6份，按“1.3.2”節(jié)中規(guī)定的方法處理，得供試品溶液，測(cè)定條件依“1.3.3”節(jié)中規(guī)定，檢出鹽酸土霉素490.33 mg·kg-1(RSD=3.47%)，鹽酸四環(huán)素611.02 mg·kg-1(RSD=3.45%)，磺胺嘧啶221.70 mg·kg-1(RSD=7.24%)，磺胺甲嘧啶227.30 mg·kg-1(RSD=6.35%)，氧氟沙星192.14 mg·kg-1(RSD=3.81%)，諾氟沙星160.85 mg·kg-1(RSD=6.24%)，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好.

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

在西安周邊8個(gè)生豬養(yǎng)殖場(chǎng)采集豬糞樣本，采集好的樣本保存于加冰袋的泡沫盒中，并于4 h內(nèi)儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱，采用本實(shí)驗(yàn)所建立的方法進(jìn)行分析.結(jié)果表明，鹽酸土霉素和鹽酸四環(huán)素檢出率均為100%，磺胺嘧啶檢出率為62.5%，氧氟沙星檢出率為37.5%，諾氟沙星檢出率為12.5%，磺胺甲嘧啶未檢出.其中，以豬糞干基計(jì)，殘留抗生素含量較高為鹽酸四環(huán)素和鹽酸土霉素，含量范圍分別為67.82～719.74 mg·kg-1和17.48～552.74 mg·kg-1.

從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)抗生素在采集的豬糞樣本中檢出率較高，且殘留量也較大.畜禽糞便的隨意排放易導(dǎo)致殘留的抗生素對(duì)水體和環(huán)境的污染，并最終通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)，對(duì)人類(lèi)健康造成危害.此外，積累在環(huán)境中的抗生素作用于微生物，極易導(dǎo)致環(huán)境中耐藥細(xì)菌和抗性基因的產(chǎn)生，從而對(duì)整個(gè)生態(tài)環(huán)境帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn).因此，積極開(kāi)展畜禽糞便中殘留抗生素的監(jiān)測(cè)和治理具有非常重要的意義.

3 結(jié)論

QuEChERS技術(shù)是基于分散固相萃取建立起來(lái)的一種樣品前處理技術(shù)，具有萃取凈化步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)范圍廣，回收率高，分析速度快，溶劑使用量少等優(yōu)點(diǎn)[16,17].近年來(lái)在農(nóng)產(chǎn)品及食品加工品檢測(cè)等方面應(yīng)用廣泛，并逐步擴(kuò)大到環(huán)境、紡織等行業(yè).本實(shí)驗(yàn)針對(duì)畜禽糞便中殘留的常見(jiàn)3類(lèi)(喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi))6種抗生素，采用QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS法對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析.

結(jié)果表明，新鮮豬糞樣品經(jīng)冷凍干燥，乙腈提取，Cleanert LipoNo管凈化，然后采用UPLC-MS/MS檢測(cè)，該方法較HLB固相萃取柱凈化前處理方法簡(jiǎn)單，分析速度快，準(zhǔn)確度和精密度均良好，可用于畜禽糞便中常見(jiàn)抗生素殘留的分析檢測(cè).此外，本方法在凈化過(guò)程中所用Cleanert LipoNo為大顆粒填料，無(wú)需離心，從而進(jìn)一步簡(jiǎn)化了前處理操作[18]，適合大量樣品的處理，具有較好的發(fā)展前景.