扈海靜 彭煒航 王日東 鄭文彩 王建瑞*

（1魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東煙臺(tái)264025；2山東博華高效生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東濱州256500；3山東招遠(yuǎn)市國(guó)有羅山林場(chǎng)，山東濱州256400；4山東省利津縣中心醫(yī)院，山東東營(yíng)257400）

鬼傘屬（Coprinus）真菌屬于擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidomycotina），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales），鬼傘科（Coprinaceae），約有100 多種，我國(guó)記載有20 多種[1]。目前已有研究表明，鬼傘的某些發(fā)酵產(chǎn)物，可作為新的抗生素資源，對(duì)代表性的革蘭氏陽(yáng)性菌有較高的抑菌活性，而且對(duì)豬鼻支原體和萊氏非固醇衣原體也表現(xiàn)出較高的抗性[2]。毛頭鬼傘是鬼傘屬的一種，據(jù)報(bào)道，它能降低血糖，并含有治療糖尿病的有效成分[3]。如今，環(huán)境問(wèn)題是世界關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，大多數(shù)化工廠排放的廢水中都含有酚類(lèi)物質(zhì)，鬼傘屬真菌中的C.cinereus和C.congeregatus可以降解酚類(lèi)物質(zhì)，其中C.cinereus的酚類(lèi)過(guò)氧化氫酶對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)及其類(lèi)似物都有較好的降解作用[4]。國(guó)外一些研究發(fā)現(xiàn)C.comatus對(duì)鉛、銀、汞等某些重金屬元素具有較好的富集作用，可將其作為環(huán)境污染的指示菌物[5]。

灰擬鬼傘夏秋季單生或散生于糞土、草地上，我國(guó)主要分布在東北、華北、西北、華中等區(qū)域。鬼傘功效及其含有的特有成分已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。筆者探究灰擬鬼傘的生物學(xué)特性，為鬼傘的菌絲體培養(yǎng)及其研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

山東省聊城市莘縣草菇栽培床上的灰擬鬼傘（Coprinopsis cinerea）經(jīng)組織分離得到供試菌株。該菌株經(jīng)過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)以及形態(tài)性狀測(cè)定等已鑒定為灰擬鬼傘（圖1）。

圖1 灰擬鬼傘

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，加水1 000 mL，pH自然。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

1.3.1.1 碳源試驗(yàn)

采用PDA 培養(yǎng)基，碳源分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖，其他成分不變，配制250 mL 培養(yǎng)基，并倒入7 個(gè)平板。培養(yǎng)基平板正中央接入6 mm 大小相同的菌塊，置24 ℃培養(yǎng)。每隔24 h觀察一次并用平板劃線法測(cè)量標(biāo)記菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度。連續(xù)測(cè)量直至出現(xiàn)某一平板長(zhǎng)滿菌絲。同時(shí)觀察并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)，繪制折線圖。每個(gè)處理設(shè)7個(gè)重復(fù)。

1.3.1.2 氮源試驗(yàn)

采用PDA 培養(yǎng)基，氮源分別為酵母粉、蛋白胨、尿素、牛肉膏，其他成分不變。接種、培養(yǎng)、測(cè)量方法同碳源試驗(yàn)。每個(gè)處理設(shè)7個(gè)重復(fù)。

1.3.1.3 pH試驗(yàn)

采用 PDA 培養(yǎng)基，設(shè)置 pH 為 5、6、7、8、9、10 等6 個(gè)梯度。接種、培養(yǎng)、測(cè)量方法同碳源試驗(yàn)。每個(gè)處理設(shè)7個(gè)重復(fù)。

1.3.1.4 溫度試驗(yàn)

選取碳源為蔗糖、氮源為酵母粉、pH 為7 的培養(yǎng)基，接種后分別放置于24 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃的恒溫生物培育箱培養(yǎng)。測(cè)量方法同碳源試驗(yàn)。每個(gè)處理設(shè)7個(gè)重復(fù)。

1.3.2 正交試驗(yàn)

從4 種單因素中選出培養(yǎng)效果最佳者，組成4因素4 水平的正交試驗(yàn)（表1）。具體方法是采用PDA 培養(yǎng)基，分別添加相應(yīng)的碳源、氮源，改變pH以及溫度，置于不同環(huán)境下培養(yǎng)。接種、測(cè)量方法同碳源試驗(yàn)。每個(gè)處理設(shè)7個(gè)重復(fù)。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源試驗(yàn)結(jié)果

觀察發(fā)現(xiàn)在供試碳源培養(yǎng)基上灰擬鬼傘菌絲前3 d 長(zhǎng)勢(shì)差異不大，第4 天時(shí)開(kāi)始有差異，在第9天時(shí)差異較顯著，以蔗糖為碳源的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好。由圖1 可見(jiàn)，菌絲在以蔗糖為碳源培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)始終最快，其次是麥芽糖、果糖，最慢是葡萄糖。

圖2 供試碳源對(duì)灰擬鬼傘菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2 可以看出，灰擬鬼傘菌絲在4 種碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中以蔗糖為碳源時(shí)，菌絲平均長(zhǎng)速最快，為3.29 mm/d。以蔗糖為碳源時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于其他碳源，因此蔗糖可作為最佳碳源。

表2 供試碳源培養(yǎng)基上菌絲平均長(zhǎng)速及長(zhǎng)勢(shì)的影響

2.2 氮源試驗(yàn)結(jié)果

同碳源試驗(yàn)，培養(yǎng)前3 d 灰擬鬼傘菌絲的生長(zhǎng)差異不明顯，從第4天開(kāi)始菌絲生長(zhǎng)出現(xiàn)分化，尿素為氮源的培養(yǎng)基上菌絲幾乎不生長(zhǎng)；第9天時(shí)，在酵母粉作為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)極旺盛，且粗而潔白。由圖3 可見(jiàn)，酵母粉為氮源培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)始終為最快，其次是蛋白胨、牛肉膏，最慢是尿素。

由表3 可知，菌絲在以尿素為氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)極緩慢，長(zhǎng)勢(shì)差；酵母粉為氮源培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)效果最好，因而選擇酵母粉作為最佳氮源。

圖3 供試氮源對(duì)灰擬鬼傘菌絲生長(zhǎng)的影響

表3 供試氮源培養(yǎng)基上菌絲平均長(zhǎng)速及長(zhǎng)勢(shì)

2.3 pH試驗(yàn)結(jié)果

由表4 可知，培養(yǎng)基pH 5～10 灰擬鬼傘菌絲均可生長(zhǎng)，pH 7 菌絲生長(zhǎng)最佳。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)pH 偏酸性時(shí)制作固體培養(yǎng)基不易凝固，因此制作培養(yǎng)基時(shí)可適當(dāng)提高pH以利于培養(yǎng)基凝固。

圖4 供試pH灰擬鬼傘菌絲生長(zhǎng)的影響

表4 不同pH培養(yǎng)基上菌絲平均長(zhǎng)速及長(zhǎng)勢(shì)

2.4 溫度試驗(yàn)結(jié)果

由圖5 可見(jiàn)，培養(yǎng)溫度24～37 ℃灰擬鬼傘菌絲均能正常生長(zhǎng)，在40 ℃時(shí)，生長(zhǎng)很緩慢，31 ℃生長(zhǎng)最快。24～37 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度相差不大。

圖5 供試溫度對(duì)灰擬鬼傘菌絲生長(zhǎng)的影響

由表5 可知，溫度31 ℃菌絲長(zhǎng)速最快，長(zhǎng)勢(shì)最好，所以31 ℃是菌絲最適生長(zhǎng)溫度。

表5 供試培養(yǎng)溫度條件菌絲平均長(zhǎng)速及長(zhǎng)勢(shì)

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表6 可知，以蔗糖為碳源、酵母粉為氮源、培養(yǎng)溫度31 ℃、pH9 時(shí)，灰擬鬼傘菌絲長(zhǎng)速最快，為4.15 mm/d。綜合灰擬鬼傘菌絲長(zhǎng)速與長(zhǎng)勢(shì)可以確定，碳源以蔗糖、氮源以酵母粉（可選擇替換蛋白胨）、溫度31 ℃、pH 9為灰擬鬼傘菌絲體培養(yǎng)的最佳配方及培養(yǎng)條件。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

單因素試驗(yàn)中，以蔗糖為碳源時(shí)，灰擬鬼傘菌絲生長(zhǎng)迅速且比其他幾種碳源生長(zhǎng)更粗壯，更均勻；以酵母粉為氮源時(shí)，菌絲潔白粗壯，長(zhǎng)勢(shì)旺盛；培養(yǎng)溫度24～37 ℃菌絲均可正常生長(zhǎng)；培養(yǎng)基pH 為5～10時(shí)菌絲均能生長(zhǎng)，pH 7時(shí)菌絲生長(zhǎng)最佳。

正交試驗(yàn)得出，灰擬鬼傘菌絲體最適培養(yǎng)條件是碳源為蔗糖，氮源可選擇酵母粉或蛋白胨，pH 6～9，培養(yǎng)溫度31～34 ℃，在此條件下灰擬鬼傘菌絲均能生長(zhǎng)良好。