范冬茹 郭 興 王丹麗 馬 珂 高智濤

（伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江伊春153000）

羊肚菌（Morchella denta）又名美味羊肚菌，俗稱羊雀菌、包谷菌等，隸屬于子囊菌亞門（Aseomycoti—na）、盤菌（Diseomyeetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella）[1]。羊肚菌野生資源分布較廣，我國陜西、甘肅、青海、四川、云南、河北、內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江等20 多個(gè)?。▍^(qū)）均有分布，但采收量稀少[2]。

伊春市位于中國黑龍江省東北部小興安嶺腹地的湯旺河流域，屬寒溫帶大陸性季風(fēng)氣候，森林覆蓋率約為82.2%，擁有亞洲面積最大、保存最完整的紅松原始林。伊春地區(qū)野生食藥用真菌資源非常豐富，夏秋兩季是野生菌的發(fā)生期，其中羊肚菌也時(shí)有發(fā)生，但有關(guān)該地區(qū)野生羊肚菌資源的種類和分類少有報(bào)道。筆者對(duì)伊春地區(qū)的一株野生羊肚菌進(jìn)行分離、鑒定，并對(duì)菌絲的生長特性進(jìn)行分析，以期為羊肚菌的人工馴化和資源利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試羊肚菌

野生羊肚菌2019 年6 月14 日采自黑龍江省伊春市伊春區(qū)小興安嶺植物園內(nèi)，編號(hào)為YYC-1。測(cè)量其子實(shí)體整體長度、菌蓋高度等。

1.2 供試培養(yǎng)基

菌種分離及保存培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然。

液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白 胨 2 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，pH 自 然 ，水1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種分離與鑒定

采用孢子分離方法中的彈射法[3]獲得純菌種。將分離出的菌種送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行ITS 的分子鑒定。首先提取菌絲體總DNA，ITS 部分序列 PCR 擴(kuò)增用真菌 ITS 通用引物ITSl 和 ITS4，PCR 反應(yīng)體系 25 μL。產(chǎn)物回收并測(cè)序，利用BLAST在線比對(duì)進(jìn)行序列分析。

1.3.2 菌絲培養(yǎng)試驗(yàn)

1.3.2.1 菌絲斜面培養(yǎng)

選取菌絲生長旺盛、速度一致的試管種，挑取相同大小的菌塊接種于PDA斜面，放置20 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10 個(gè)重復(fù)。每天觀察菌絲顏色變化及菌絲長勢(shì)直至菌絲長滿試管，并根據(jù)測(cè)得的菌絲生長長度和培養(yǎng)天數(shù)計(jì)算菌絲平均生長速度。

1.3.2.2 菌絲生長適宜碳氮源試驗(yàn)

以液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖和蛋白胨含量為標(biāo)準(zhǔn)，用相同含量的蔗糖、乳糖、可溶性淀粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，用相同質(zhì)量酵母浸膏、黃豆粉、尿素代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源。250 mL 三角瓶裝液150 mL，3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)基滅菌后，在無菌條件下，分別將10個(gè)活化的菌塊接入各培養(yǎng)基中，20 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液倒入抽濾瓶中抽濾，抽濾過程中加入少許流動(dòng)蒸餾水沖洗菌絲體，抽濾后得到較干的菌絲體，再放置于烘箱中，70 ℃烘干后稱量。

1.3.2.3 pH試驗(yàn)

用NaOH、HCl 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的 pH 分別調(diào)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。每個(gè)處理重復(fù)3 次。培養(yǎng)方法及菌絲體生物量測(cè)定同1.3.2.2。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS21 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生羊肚菌的形態(tài)特征

所采集的野生羊肚菌YYC-1為黃色羊肚菌（圖1）。子實(shí)體中等大小，平均長度為11 cm，平均寬度為5 cm，菌蓋棕黃色、卵圓形，凹坑不規(guī)則扭曲，菌柄長約5 cm，寬約3 cm。

2.2 羊肚菌YYC-1的菌株鑒定及系統(tǒng)發(fā)育

菌株擴(kuò)增的ITS 片段經(jīng)測(cè)序得到一個(gè)長度為1 162 bp 的序列（圖2），將此結(jié)果在 NCBI 上BLAST 比對(duì)（限于篇幅，省略比對(duì)表）。結(jié)果，最大匹配值為2 109～2 084，對(duì)比程度大；覆蓋率最高可達(dá)99%；E 值為0，說明對(duì)比完成匹配；最大一致性為99.74%～99.14%，表明對(duì)比結(jié)果相似性極高。綜合得出，在10 個(gè)對(duì)比結(jié)果中，YYC-1 與8 組粗腿羊肚菌（Morchella crassipes）相似程度較高，可以初步確定該野生羊肚菌菌株為粗腿羊肚菌。

2.3 菌絲培養(yǎng)結(jié)果

2.3.1 斜面培養(yǎng)結(jié)果

斜面培養(yǎng)1 d 后全部萌發(fā)，菌絲潔白纖細(xì)，平均生長長度為5.04 mm；接種5 d 后，菌絲變?yōu)闇\黃色，菌絲較密；接種6 d 后，全部滿管，平均生長長度為16.88 mm，且菌絲變?yōu)辄S褐色（圖3）；接種第10 天，菌絲濃密，氣生菌絲較多，顏色轉(zhuǎn)為深褐色，表面有少量菌核出現(xiàn)。

圖1 野生羊肚菌子實(shí)體

圖2 PCR電泳圖譜

圖3 接種6 d時(shí)菌絲狀態(tài)

2.3.2 碳源對(duì)YYC-1菌絲生長的影響

由表1 可知，野生羊肚菌YYC-1 在供試碳源培養(yǎng)基中均可生長，菌絲體生物量存在顯著差異。菌絲體生物量大小依次為葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞可溶性淀粉，且葡萄糖與其他三種碳源在0.05 水平上差異顯著；以葡萄糖、可溶性淀粉為碳源的發(fā)酵液顏色呈淺黃色，以蔗糖、乳糖為碳源的發(fā)酵液顏色呈褐色（圖4）。綜合菌絲長勢(shì)，YYC-1 的最適碳源為葡萄糖。

表1 碳源對(duì)YYC-1菌絲生長的影響

圖4 不同碳源發(fā)酵液顏色

2.3.3 氮源對(duì)YYC-1菌絲生長的影響

由表2 可知，野生羊肚菌YYC-1 在供試氮源培養(yǎng)基中均可生長。菌絲體生物量大小依次為酵母浸膏＞黃豆粉＞尿素＞蛋白胨，且酵母浸膏與其他三種氮源在0.05 水平上存在顯著性差異；以酵母浸膏、黃豆粉為氮源的發(fā)酵液顏色呈淺黃色，以尿素、蛋白胨為氮源的發(fā)酵液顏色呈褐色。綜合菌絲長勢(shì)，YYC-1的最適氮源為酵母浸膏。

表2 氮源對(duì)YYC-1菌絲生長的影響

2.4 pH對(duì)YYC-1菌絲生長的影響

由表3 可知，野生羊肚菌 YYC-1 在 pH 為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的培養(yǎng)基中均可生長，當(dāng) pH 在6.0～7.5 時(shí)，隨著pH 上升，菌絲體生物量不斷增加、菌絲長勢(shì)由弱變強(qiáng)、發(fā)酵液顏色由淺變深；當(dāng)pH 為8時(shí)，菌絲生物量有所下降、菌絲長勢(shì)變?nèi)?，表明YYC-1適合在偏堿性的培養(yǎng)基中生長，最適pH為7.5。

表3 pH對(duì)YYC-1菌絲生長的影響

3 小結(jié)

編號(hào)為YYC-1 的野生羊肚菌采自小興安嶺伊春地區(qū)闊葉次生林林下。采集地生境枯枝落葉層較厚，腐殖質(zhì)較多（符合食用菌對(duì)有機(jī)質(zhì)的要求），采集當(dāng)年的雨水較多，土壤濕潤，為羊肚菌的生長提供良好生態(tài)條件。YYC-1擴(kuò)增的ITS片段經(jīng)測(cè)序得到一個(gè)長度為1 162 bp的序列，在BLAST比對(duì)后，確定其為粗柄羊肚菌（Morchella crassipes）。對(duì)YYC-1 生長所需的碳源、氮源、pH 三個(gè)因素試驗(yàn)，結(jié)果表明，其生長最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母浸膏，最適pH為7.5。