龔琦 陳素華 馬超

[摘要] 目的 觀察鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV）感染小鼠胎盤(pán)病理學(xué)改變對(duì)子代宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育情況的影響。 方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法，在性成熟期小鼠中選取未感染MCMV的雌鼠，進(jìn)行合籠受孕。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對(duì)照組與模型組，各8只。在孕齡12.5 d時(shí)，模型組透過(guò)胎盤(pán)進(jìn)行MCMV懸液顯微注射，對(duì)照組注射等量培養(yǎng)基溶液;在孕齡18.5 d時(shí)，斷頸法處死雌鼠，觀察98只胎鼠各個(gè)器組織標(biāo)本病理改變。 結(jié)果 模型組胎盤(pán)感染率和胎仔感染率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。有胎盤(pán)感染小鼠中胎仔感染率明顯高于無(wú)胎盤(pán)感染者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;在有胎盤(pán)感染小鼠中，有細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增生、合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增生及纖維素樣壞死者發(fā)生死胎和異常胎仔率明顯高于無(wú)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增生、合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增生及纖維素樣壞死者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;有纖維素樣壞死者畸胎率明顯高于無(wú)纖維素樣壞死者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 經(jīng)胎盤(pán)感染MCMV是導(dǎo)致宮內(nèi)感染的重要途徑，MCMV感染是導(dǎo)致子代不良妊娠結(jié)局重要原因。

[關(guān)鍵詞] 巨細(xì)胞病毒;小鼠;胎盤(pán)感染;病理學(xué);生長(zhǎng)發(fā)育

[中圖分類號(hào)] R373.9 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）06（a）-0020-04

[Abstract] Objective To observe the efficacy of pathological placental changes after intrauterine murine cytomegalovirus （MCMV） infection on the intrauterine growth and development of fetal mice. Methods The mature mice without MCMV infection identified by enzyme-linked immunoabsorbent assay were served as the subjects. The male and the female mice were put into the same cage. According to the method of random number table， the mice were randomly divided into control group and model group， with 8 mice in each group. At day 12.5 of gestation， the placentas of the model group were injected with MCMV， while the control group was injected with cell maintenance medium. All female mice were executed at day 18.5 of gestation， and the change of tissues and organs of 98 fetal mice were observed. Results The placental infection rate and fetal infection rate in the model group were significantly higher than those in the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. In the placenta infection mice， the fetal infection rate increased significantly compared with those without placenta infection， the difference was statistically significant （P < 0.05）. In the placenta infection mice， the rates of stillbirths and abnormal fetuses in mice with cytotrophoblast proliferative， syncytial trophoblast nodules and fibrinoid necrosis were significance higher than those without cytotrophoblast proliferative， syncytial trophoblast nodules and fibrinoid necrosis， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The teratogenic rate in mice with fibrinoid necrosis was significantly higher than those without fibrinoid necrosis， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The MCMV infection through placenta is an important approach for intrauterine infection. MCMV infection is an important cause of adverse pregnancy outcomes in offspring.

[Key words] Murine cytomegalovirus; Mice; Placental infection; Pathology; Growth and development

巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）具有潛伏期和再活化的生物學(xué)特性，可以導(dǎo)致終身感染[1]。人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）宮內(nèi)感染對(duì)新生兒的出生結(jié)局產(chǎn)生嚴(yán)重影響[2]。孕婦感染HCMV會(huì)發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸胎、死胎及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育落后等不良妊娠結(jié)局[3-5]。HCMV感染可改變胎盤(pán)組織結(jié)構(gòu)[6]，從而影響胎盤(pán)功能及子代發(fā)育。

1 材料與方法

1.1 病毒

鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV）Smith株購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（Chinese Center for Type Culture Collection，CCTCC），TCID50為104.55（即2.8×105）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 ?于湖北省疾控中心購(gòu)買(mǎi)SPF級(jí)BALB/c雌鼠和雄鼠各20只，均為90 d齡，體重（22±2）g，飼養(yǎng)于同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2016-0057，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：1394527。使用酶聯(lián)免疫吸附法篩選未感染MCMV小鼠，方法參考說(shuō)明書(shū)。將雌雄小鼠1∶1合籠，觀察小鼠陰道，發(fā)現(xiàn)陰栓則為孕0 d。在孕12.5 d向?qū)φ战M小鼠胎盤(pán)注射1 μL 3% FCS DMEM培養(yǎng)液;模型組小鼠胎盤(pán)注射1 μL MCMV上清，至少有1只胎鼠在孕鼠宮內(nèi)保持5 d，即為建模成功[7]。

1.2.2 標(biāo)本采集及處理 ?斷頸法處死孕18.5 d雌鼠，將活胎鼠、死胎鼠（包括吸收胎）依次取出。觀察胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況：取出活胎后，選取雌性胎鼠，用Sartorius BS系列精密電子天平稱重，使用分規(guī)分別測(cè)量胎鼠的身長(zhǎng)和體長(zhǎng)[8]。采集胎鼠主要臟器和胎盤(pán)組織標(biāo)本，用緩沖液沖洗碾磨制備勻漿，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)MCMV DNA[9]。胎盤(pán)MCMV DNA陽(yáng)性判定為胎盤(pán)感染;胎仔任一臟器組織標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性則視為胎仔感染。

1.2.3 主要試劑及儀器 ?DMEM培養(yǎng)基購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Hyclone公司（SH30022.01B），胎牛血清均購(gòu)買(mǎi)于Gibco公司（10270-106）;DNA提取試劑購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)QIAGEN公司（LOT：163020026）;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒從美國(guó)Trinity Biotech公司（IgM：904075;IgG：901389）購(gòu)買(mǎi)，采用北京百晶生物技術(shù)有限公司BG-gdsAUTOTIO0型酶標(biāo)儀（20620017020002）判斷結(jié)果;引物交由上海生工生物工程公司合成[7]。

1.2.4 胎盤(pán)病理學(xué)檢測(cè) ?使用4%多聚甲醛固定標(biāo)本，常規(guī)制作成石蠟切片（厚度4 μm）后顯微鏡檢，觀察絨毛組織的病理學(xué)變化。通過(guò)日本OLYMPUS BX50顯微鏡及HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集、編輯[10-11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher直接概率法（雙側(cè)）檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎盤(pán)感染與胎仔感染情況

模型組胎盤(pán)感染率（64%，32只）明顯高于對(duì)照組（0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。在所有98個(gè)標(biāo)本中，模型組胎仔感染率（32%，16只）明顯高于對(duì)照組（0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。有胎盤(pán)感染的胎仔感染率（43.75%，14只）明顯高于無(wú)感染者（3.00%，2只），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 胎盤(pán)病理學(xué)改變對(duì)子代生長(zhǎng)發(fā)育的影響

模型組胎盤(pán)鏡下可見(jiàn)典型病毒包涵體，感染的胎盤(pán)內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增生、合體滋養(yǎng)細(xì)胞結(jié)節(jié)增生以及纖維素樣壞死，見(jiàn)圖1（封三）。在胎盤(pán)感染的小鼠中，有細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增生、合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增生及纖維素樣壞死者發(fā)生死胎和異常胎仔率明顯高于無(wú)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增生、合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增生及纖維素樣壞死者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;胎盤(pán)是否存在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增生或合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增生與其胎仔畸胎發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;有纖維素樣壞死者畸胎率明顯高于無(wú)纖維素樣壞死者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1～3。

3 討論

3.1 研究意義

關(guān)于妊娠期HCMV感染引起宮內(nèi)傳播機(jī)制尚不清楚。因此，有必要了解HCMV宮內(nèi)傳播機(jī)制，為疾病預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。

HCMV經(jīng)血透過(guò)胎盤(pán)感染是宮內(nèi)感染的重要途徑。HCMV感染后破壞胎盤(pán)淋巴管形成以及血管重構(gòu)，阻礙人滋養(yǎng)層細(xì)胞祖細(xì)胞的發(fā)育，使絨毛生長(zhǎng)停滯的在早期階段，阻止其分化和融合為合胞滋養(yǎng)層細(xì)胞[11-12]。正常妊娠生理中胎盤(pán)絨毛直徑減小從而擴(kuò)大母胎間血氧交換表面積。絨毛內(nèi)血管發(fā)生充血改變，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量減少甚至消失。此時(shí)，妊娠晚期絨毛的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞就被合體滋養(yǎng)細(xì)胞所替代，并積聚形成多細(xì)胞結(jié)節(jié)。在部分細(xì)胞結(jié)節(jié)內(nèi)可以觀察到細(xì)胞核裂解消失，細(xì)胞漿厚度變薄，圍繞絨毛血管周圍，形成血管合體細(xì)胞膜，這種結(jié)構(gòu)可以更好地促進(jìn)母體與胎兒之間的氣體交換。妊娠期內(nèi)，蛻膜中血管也呈現(xiàn)適應(yīng)性改變，更好地順應(yīng)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)有利于孕產(chǎn)婦持續(xù)妊娠以及分娩[13]。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)環(huán)境改變時(shí)，胎盤(pán)會(huì)發(fā)生一系列病理性改變，殘存的絨毛出現(xiàn)間質(zhì)水腫、淤血。胎盤(pán)蛻膜血管呈現(xiàn)出病理性改變，螺旋動(dòng)脈血管管壁纖維化，管腔狹窄，導(dǎo)致母胎間物質(zhì)交換受阻，影響胎兒發(fā)育[14-15]。

3.2 MCMV胎盤(pán)感染對(duì)子代感染的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠感染MCMV的病理與人感染CMV相似。模型組胎盤(pán)鏡下可見(jiàn)典型病毒包涵體，有胎盤(pán)感染子代MCMV的感染率明顯提高，無(wú)胎盤(pán)感染時(shí)2只小鼠出現(xiàn)子代感染陽(yáng)性，可能提示既往感染，現(xiàn)在病毒檢測(cè)已轉(zhuǎn)陰。上述結(jié)論證實(shí)了經(jīng)胎盤(pán)感染是導(dǎo)致宮內(nèi)感染的重要途徑。HCMV感染后可產(chǎn)生毒血癥，病毒可直接損傷接觸細(xì)胞引起宮內(nèi)感染，造成宿主的多器官損傷[16]。HCMV病毒可以侵入胎盤(pán)滋養(yǎng)層，通過(guò)絨毛基質(zhì)進(jìn)入胎兒體內(nèi)，引起宮內(nèi)感染，使胎兒組織器官分化推遲或中斷，出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育異常情況[17]。

3.3 MCMV胎盤(pán)感染導(dǎo)致胎盤(pán)病理學(xué)改變對(duì)子代生長(zhǎng)發(fā)育的影響

感染的胎盤(pán)內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增生、合體滋養(yǎng)細(xì)胞結(jié)節(jié)增生以及纖維素樣壞死等病理改變，可對(duì)子代生長(zhǎng)發(fā)育造成一定影響。合體細(xì)胞發(fā)生損傷引起細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增生，是胎盤(pán)絨毛自身修復(fù)的表現(xiàn);合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增多通常是由胎盤(pán)絨毛缺血缺氧導(dǎo)致;而機(jī)體免疫復(fù)合物反應(yīng)導(dǎo)致纖維素樣壞死[18]。CMV感染胎盤(pán)后，介導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致部分絨毛發(fā)生病理改變，同時(shí)改變蛻膜細(xì)胞因子和趨化因子環(huán)境[19]，加重胎盤(pán)病理改變。CMV在胎盤(pán)中復(fù)制可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移失調(diào)[12]。Hamilton等[20]研究表明，單核細(xì)胞趨化蛋白-1和腫瘤壞死因子-α表達(dá)上調(diào)亦可對(duì)胎盤(pán)和胎兒造成損傷。

綜上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了經(jīng)血透過(guò)胎盤(pán)感染是MCMV感染的重要途徑，MCMV感染可能是引起新生兒不良妊娠結(jié)局的重要原因。

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（收稿日期：2019-10-16 ?本文編輯：任 ?念）