李慧 楊會 白云綺

[摘要] 目的 篩選四妙勇安湯具有過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）激活作用的活性部位，并對其化學成分進行分析，探討提取物的活性成分和抗炎作用。 方法 采用醇水提取、樹脂分離獲得四妙勇安湯的8個提取物，以PPAR-γ為靶點，于細胞水平篩選四妙勇安湯提取物的活性部位，對有活性趨勢的提取物繪制劑量依賴性曲線，計算EC50值以及相對活性，并采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對活性部位的化學成分進行分析鑒定。 結(jié)果 PPAR-γ激動模型中，提取物CS04及CS05具有較強的PPAR-γ激活作用。對活性部位CS04和CS05進行化學成分鑒定，共鑒別出31個成分。 結(jié)論 四妙勇安湯提取物CS04和CS05具有較強激活PPAR-γ作用，這一作用可能與其抑制動脈粥樣硬化炎癥有關。

[關鍵詞] 四妙勇安湯提取物;過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑;激活作用;化學成分;液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

[中圖分類號] R286.0 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）06（a）-0028-06

[Abstract] Objective To screen the active parts of Simiao Yong′an Decoction with peroxisome proliferators-activated receptor γ （PPAR-γ） activation and analyze its chemical components， and to explore the active components and anti-inflammatory effects of the extract. Methods Eight alcohol extracts of Simiao Yong′an Decoction were obtained by alcohol extraction and resin separation. The PPAR-γ was used as the target to screen the active parts of the extract of Simiao Yong′an Decoction at the cell level. A dose-dependent curve was drawn for the extracts with active tendency. EC50 value and relative activity value were calculated， and the chemical composition of active parts was analyzed and identified by liquid chromatograph-tandem mass spectrometer technology. Results In the PPAR-γ activation model， the extracts CS04 and CS05 have strong PPAR-γ activation. The chemical components of the active parts CS04 and CS05 with strong PPAR-γ agonistic effects were identified. A total of 31 components were identified. Conclusion CS04 and CS05 of Simiao Yong′an Decoction have strong PPAR-γ activation， which may be related to the inhibition of atherosclerosis inflammation.

[Key words] Simiao Yong′an Decoction; Peroxisome proliferators-activated receptor γ agonist; Activity screening; Chemical composition; Liquid chromatograph-mass spectrometer

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病的重要病理基礎，由其引起的心血管疾病已成為我國最主要的致死和致殘的疾病之一[1]。AS發(fā)病機制較為公認的是慢性血管炎癥學說[2-3]。近年來，研究顯示[5-6]PPAR-γ是炎性反應和細胞增殖的調(diào)節(jié)劑，能夠?qū)ρ装Y介質(zhì)進行負反饋調(diào)節(jié)[4]，減少單核/巨噬細胞炎癥基因的表達，減輕免疫和炎性反應[7]，從而延緩AS發(fā)展，穩(wěn)定斑塊，防止破裂。

四妙勇安湯由金銀花、玄參、當歸和甘草組成，廣泛用于治療以AS為病理基礎的多種血管病變，臨床療效顯著[8-9]。研究顯示[12]，四妙勇安湯可以通過活化斑塊內(nèi)PPAR-γ的表達，有效減少多種炎性因子釋放[10-11]，抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）表達，控制AS炎性反應，增強斑塊的穩(wěn)定性。本研究以PPAR-γ為靶點篩選四妙勇安湯提取物，并對活性部位化學成分進行分析，旨在為闡明發(fā)揮抗AS炎癥的物質(zhì)基礎及深入探討其藥理機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100 series HPLC system（美國Agilent公司），包括二元泵、在線脫氣機、自動進樣器和DAD檢測器;Agilent 6320 Ion Trap XCT型離子阱質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）;水套式二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）;EnSpireTM 2300 Multilabel Reader（美國PerkinElmer公司）。

非洲綠猿猴腎細胞（CV-1，中國科學院上海細胞種質(zhì)庫提供），PPRE質(zhì)粒、PPAR-γ質(zhì)粒、RXRα質(zhì)粒均由中國科學院上海藥物研究所提供，DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Gibco公司），Bright-Glo Luciferase熒光素酶檢測試劑（美國Promega公司），羅格列酮[葛蘭素史克（天津）有限公司]。對照品：綠原酸（110753-200413）、木犀草苷（111720-200905）、哈巴苷（111729-200603）、哈巴俄苷（111730-200605）、甘草苷（111610-201005）和甘草酸銨（110731-200615）均購自中國食品藥品檢定研究院。標準藥材金銀花（121060-200906）、玄參（121008-200906）、當歸（120927-201014）、甘草（121303-200502）購自中國食品藥品檢定研究院。試驗用藥材金銀花、玄參、當歸、甘草由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供并鑒定。乙腈為色譜純（德國Merck公司）;超純水由Milli-Q系統(tǒng)制備（美國Millipore公司）;其他試劑均為分析純，購自北京化學試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取與制備

取金銀花90 g、玄參90 g、當歸60 g、甘草30 g，加8倍量55%乙醇水溶液提取4次，每次2 h，得到醇提液和殘渣，回收醇提液濃縮至干，加水混懸，采用AB-8型大孔樹脂分離，依次用純水，30%、60%和95%乙醇淋洗至流出液澄清，獲得上述4個部位，分別減壓濃縮干燥，得到篩選樣品CS02～CS05號;將殘渣用水提取2次，每次1.5 h，得到水提液，濃縮至干，留取樣品CS01號;其余樣品加水混懸，采用AB-8型大孔樹脂分離，依次用純水，55%、95%乙醇淋洗至流出液澄清，獲得以上3個部位，分別減壓濃縮干燥，得到篩選樣品CS06～CS08號。

1.2.2 CV-1轉(zhuǎn)染及熒光素酶基因表達水平檢測

將CV-1用含有10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素/鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基在37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將生長狀態(tài)良好的細胞每3天傳代，使細胞的狀態(tài)和密度均達到最佳狀態(tài)。

將含有PPAR靶序列反應元件的PPRE熒光素酶報告基因質(zhì)粒、PPAR-γ以及RXRα質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入CV-1中。轉(zhuǎn)染24 h后，以每孔3×104個細胞接種至24孔板，每孔500 μL。4 h后，加入陽性對照藥羅格列酮20 μmol/L以及待測提取物CS01～CS08，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后檢測熒光素酶基因表達水平。初篩時，提取物均以1 mg/mL作為初篩起始濃度，10倍稀釋，得到1.00、0.10、0.01、0.001 mg/mL共4個濃度;復篩時，選取初篩有活性趨勢的提取物繪制劑量依賴性曲線，計算EC50值以及相對活性。

1.2.3 活性部位化學成分的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）分析鑒定

1.2.3.1 供試品溶液的制備 ?精密稱取活性部位CS04 5.5 mg，CS05 5.1 mg置容量瓶中，加50%乙腈水定容至5 mL得供試品溶液。

1.2.3.2 對照品溶液的制備 ?精密稱取甘草苷0.8 mg、木犀草苷1.0 mg、綠原酸2.4 mg、哈巴苷2.0 mg、哈巴俄苷0.9 mg和甘草酸銨0.7 mg，混合后用50%乙腈水定容到10 mL。將各對照藥材粉碎過篩，取0.1 g置5 mL容量瓶，用50%乙腈水定容。

1.2.3.3 色譜條件 ?色譜柱：Agilent ZOBAX SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：0.1%甲酸-水（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min：5%～10% B;5～18 min：10%～17% B;18～25 min：17%～20% B;25～40 min：20%～35% B;40～80 min：35%～80% B）;柱溫：30°C;流速：1.0 mL/min;進樣量：5 μL;檢測波長：256、280、360 nm。

1.2.3.4 質(zhì)譜條件 ?柱后分流比為1∶4，20%洗脫液進入離子源。離子源參數(shù)如下：負離子檢出模式;毛細管溫度：350°C;毛細管電壓：3500 V;夾套氣（N2）流速：10 L/min;輔助氣（N2）壓力：30 psi。質(zhì)譜儀全掃描范圍m/z：100～1200。氦氣為碰撞氣體，實驗過程中碰撞能量自動選擇。

2 結(jié)果

2.1 活性部位篩選結(jié)果

以20 μmol/L羅格列酮所誘導的細胞基因活性為100%，提取物在1 mg/mL時相對活性以及EC50（mg/mL），四妙勇安湯不同部位提取物對PPAR-γ表達的促進作用。見表1。

2.2 活性部位化學成分分析

采用LC-MS/MS技術(shù)，從CS04、CS05兩個活性部位中共鑒定31個成分，對31個成分進行藥材來源的歸屬[13-16]。結(jié)果見圖1～2、表2～3。

3 討論

近年來，研究顯示[17-19]，PPAR-γ在AS易損斑塊的形成發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，PPAR-γ已經(jīng)成為防治心血管疾病的新靶點[20]。課題組前期研究顯示[21]：四妙勇安湯作為中醫(yī)解毒活血法的代表方，可以抑制多種血清炎性因子表達;動物實驗顯示其可提高斑塊內(nèi)PPAR-γ的表達，抑制AS炎性反應，防止斑塊破裂，但其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎不明確。因此，本研究制備了四妙勇安湯不同極性的提取物CS01～CS08，以PPAR-γ為靶點于細胞水平篩選出具有較強激活PPAR-γ功能活性部位，并鑒定了其化學成分。

本研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮所誘導的報告基因活性為100%，在建立的PPAR-γ激動模型中，四妙勇安湯CS04提取物在0.1 mg/mL時相對活性為100%，CS05提取物在0.01 mg/mL時相對活性為90%，在10～4 mg/mL到10～1 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴。與陽性對照藥物羅格列酮比較，兩種提取物促進PPAR-γ表達的相對活性與羅格列酮相當，提示CS04和CS05對PPAR-γ具有明顯的激活作用，因此篩選出四妙勇安湯提取物CS04和CS05兩個活性部位。

基于兩個活性部位的PPAR-γ激動作用，進一步對CS04及CS05所含化學成分采用LC-MS/MS技術(shù)進行了快速的鑒別分析。共鑒定出31種成分，對所鑒別的各成分進行歸屬，來源于金銀花3種，玄參1種，當歸1種，甘草26種，主要有黃酮類成分22個（來源于金銀花、甘草）、有機酸2個（主要來源于金銀花）、環(huán)烯醚萜1個（主要來源于玄參）、皂苷1個（主要來源于甘草）、香豆素5個（主要來源于甘草、當歸），其中黃酮類成分居多且大部分成分來自甘草。

課題組前期動物實驗顯示[21]：四妙勇安湯可通過提高斑塊內(nèi)PPAR-γ的表達，從而抑制AS炎性反應。本研究從活性篩選角度，進一步篩選獲得了2個具有較強激活PPAR-γ的活性部位，并進行了成分鑒別，初步確定了該方的活性成分，為課題組深入系統(tǒng)闡明四妙勇安湯抗AS確切的活性成分及抗炎機制研究奠定基礎。

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（收稿日期：2019-11-15 ?本文編輯：劉永巧）