楊華 牛翠

[摘要] 目的 探討改良CarbaNP法和碳青霉烯酶失活法（CIM）在耐碳青霉烯類(lèi)抗生素鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。 方法 收集2014年1月～2015年6月河北省邢臺(tái)市第三醫(yī)院臨床分離的120株鮑曼不動(dòng)桿菌和100株銅綠假單胞菌。采用全自動(dòng)微生物儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn);采用改良CarbaNP法和CIM法檢測(cè)細(xì)菌碳青霉烯酶，后采用基因檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果 120株鮑曼不動(dòng)桿菌中，碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥株和敏感株分別占61.67%和38.33%;100株銅綠假單胞菌中，碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥株和敏感株分別占60.00%和40.00%。在鮑曼不動(dòng)桿菌中，OXA-23基因攜帶率為94.59%（70/74），以其為標(biāo)準(zhǔn)，改良CarbaNP法和CIM法與基因檢測(cè)法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。改良CarbaNP法和CIM法分別與基因檢測(cè)結(jié)果比較，CIM法的敏感性和特異性均略高于改良CarbaNP法，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。在銅綠假單胞菌中，VIM-1陽(yáng)性攜帶率為93.33%（56/60），以其為標(biāo)準(zhǔn)，改良CarbaNP法和CIM法與基因檢測(cè)法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。改良CarbaNP法和CIM法分別與基因檢測(cè)結(jié)果比較，CIM法的敏感性和特異性均略高于改良CarbaNP法，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05） 結(jié)論 改良CarbaNP法和CIM法在鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類(lèi)抗生素快速檢測(cè)中均具有一定價(jià)值，以后者檢測(cè)效能較好。

[關(guān)鍵詞] 鮑曼不動(dòng)桿菌;銅綠假單胞菌;改良CarbaNP;碳青霉烯酶失活法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）06（a）-0024-05

[Abstract] Objective To investigate the application value analysis of modified CarbaNP method and carbapenems enzyme inactivation method （CIM） in the detection of carbapenem-resistant antibiotics Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa. Methods A total of 120 strains of Acinetobacter baumannii and 100 strains of Pseudomonas aeruginosa were collected from Xingtai Third Hospital， Hebei Province from January 2014 to June 2015. Bacteria identification and drug susceptibility test were carried out with automatic microbiological instrument. Modified CarbaNP method and CIM method were used to detect bacterial carbapenems， and then gene test was used for validation. Results Among the 120 Acinetobacter baumannii strains， carbapenems antibiotic resistant strains and sensitive strains accounted for 61.67% and 38.33%， respectively. Among the 100 strains of Pseudomonas aeruginosa， carbapenems antibiotic resistant strains and sensitive strains accounted for 60.00% and 40.00% respectively. In Acinetobacter baumannii， the OXA-23 gene carrying rate was 94.59% （70/74）， which was taken as the standard， and there was no significant difference between the modified CarbaNP method and the CIM method and the gene detection method （P > 0.05）. The modified CarbaNP method and the CIM method were compared with the results of the genetic test respectively which showed that the sensitivity and specificity of the modified CarbaNP method and the CIM method were slightly higher than that of the modified CarbaNP method， but the differences were not statistically significant （P > 0.05）. In Pseudomonas aeruginosa， the positive carrying rate of VIM-1 was 93.33% （56/60）， which was taken as the standard， and there was no significant difference between the modified CarbaNP method and the CIM method and the gene detection method （P > 0.05）. The modified CarbaNP method and the CIM method were compared with the results of the genetic test respectively which showed that the sensitivity and specificity of the modified CarbaNP method and the CIM method were slightly higher than that of the modified CarbaNP method， but the differences were not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion The modified CarbaNP method and CIM method have some value in the rapid detection of carbapenem-resistant Antibiotics acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa， and the latter has better detection efficiency.

[Key words] Acinetobacter baumannii; Pseudomonas aeruginosa; Modified CarbaNP; Carbapenems enzyme inactivation method

鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌是臨床常見(jiàn)的一種非發(fā)酵條件下致病的革蘭陰性桿菌，當(dāng)患者免疫力下降，其可侵襲機(jī)體，引發(fā)呼吸道、泌尿道及傷口等處感染，嚴(yán)重時(shí)可進(jìn)展為敗血癥、膿毒血癥等，威脅患者生命[1-2]。近年來(lái)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，院內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率不斷升高，僅次于銅綠假單胞菌，甚至在某些醫(yī)院其檢出率已超過(guò)銅綠假單胞菌[3]。亞胺培南和美羅培南等碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物是臨床抗革蘭陰性桿菌感染的最后防線，但近年來(lái)由于此類(lèi)藥物廣泛且大量的應(yīng)用，大多數(shù)鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌可產(chǎn)生碳青霉烯酶，導(dǎo)致對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥，使臨床抗感染治療及醫(yī)院感染控制面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[4-5]。因此盡快檢測(cè)并鑒定其耐藥性，為臨床選擇合適抗生素，減少醫(yī)療消耗及耐藥株是目前醫(yī)院感染控制的主要任務(wù)之一。目前，臨床多采用改良Hodge法和商品化Etest試紙條等檢測(cè)碳青霉烯酶，操作步驟復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、假陰性和假陽(yáng)性率較高，因此臨床急需一種簡(jiǎn)單、快速且診斷效能較高的檢測(cè)方法[6]。改良CarbaNP法和碳青霉烯酶失活法（CIM）是檢測(cè)細(xì)菌碳青霉烯酶的兩種新型方法，但尚未在臨床廣泛推廣運(yùn)用[7]。本研究收集河北省邢臺(tái)市第三醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）臨床分離的120株鮑曼不動(dòng)桿菌和100株銅綠假單胞菌，旨在探討改良CarbaNP法和CIM法在耐碳青霉烯類(lèi)抗生素鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2014年1月～2015年6月于我院臨床標(biāo)本分離的120株鮑曼不動(dòng)桿菌和100株銅綠假單胞菌，分別來(lái)自于急診室、呼吸內(nèi)科、肝膽外科、神經(jīng)外科及重癥加強(qiáng)護(hù)理病房等科室，包括血液、痰液、尿液、咽拭子、膽汁及引流液等標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定及藥物敏感檢測(cè) ?嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第3版）》[8]操作規(guī)程完成臨床標(biāo)本的采集、接種和分離，經(jīng)純培養(yǎng)后，采用VITEK-2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌分析儀（購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司）對(duì)菌種進(jìn)行鑒定和藥敏檢測(cè)，統(tǒng)一采用美洛培南和亞安培南紙片法（藥敏紙片購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：201312DT）檢測(cè)是否碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥，任意一種抗生素耐藥即可判定為碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥，后用無(wú)菌紙片將其保存于-20℃冰箱。

1.2.2 改良CarbaNP法 ?參照CLSI M100-S25文件[9]推薦方法進(jìn)行檢測(cè)，每株菌2管——A管（對(duì)照管）和B管（試驗(yàn)管）。結(jié)果判讀：①陰性（非產(chǎn)碳青霉烯）：A管和B管均為紅色;②陽(yáng)性（產(chǎn)碳青霉烯）：A管紅色、B管變?yōu)辄S色/橙色;③無(wú)效：A管和B管均變?yōu)辄S色/橙色。其中陽(yáng)性和陰性對(duì)照分別為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706。

1.2.3 CIM法 ?參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行CIM實(shí)驗(yàn)，結(jié)果判讀：①陽(yáng)性（產(chǎn)碳青霉烯）：藥敏片周?chē)鸁o(wú)抑菌環(huán);②陰性（非產(chǎn)碳青霉烯）：藥敏片周?chē)幸志h(huán)。其中陽(yáng)性和陰性對(duì)照分別為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706，空白對(duì)照為無(wú)菌水浸泡的美洛培南紙片。

1.2.4 碳青霉烯酶基因檢測(cè) ?嚴(yán)格按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：201311PX）說(shuō)明書(shū)完成DNA提取，并以此為模版檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌碳青霉烯酶相關(guān)編碼基因，其中引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[11]，在本研究中檢測(cè)的鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯酶基因包括：A類(lèi)：KPC和GES;B類(lèi)：IMP和VIM;D類(lèi)：OXA-23，銅綠假單胞菌耐碳青霉烯酶基因包括VIM-1、IMP-4、KPC-2和NDM-1，后續(xù)具體操作參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行耐藥基因PCR擴(kuò)增，并將產(chǎn)物送至上海吉?jiǎng)P生物有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥情況

120株鮑曼不動(dòng)桿菌中，74株碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥，占比為61.67%;46株碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感，占比為38.33%。100株銅綠假單胞菌中，60株碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥，占比為60.00%;40株碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感，占比為40.00%。

2.2 碳青霉烯酶相關(guān)編碼基因檢測(cè)結(jié)果

74株碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中，碳青霉烯酶A類(lèi)基因檢測(cè)均為陰性，碳青霉烯酶B類(lèi)基因中，IMP基因陽(yáng)性1株，碳青霉烯酶D類(lèi)基因中，OXA-23基因陽(yáng)性70株;46株碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感中，OXA-23基因陰性44株，碳青霉烯酶A類(lèi)和B類(lèi)均為陰性;60株碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥銅綠假單胞菌中，VIM-1陽(yáng)性56株，IMP-4陽(yáng)性1株，KPC-2和NDM-1檢測(cè)均為陰性;40株碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感銅綠假單胞菌中，VIM-1陰性37株，KPC-2和NDM-1檢測(cè)均為陰性。

2.3 改良CarbaNP法和CIM法檢測(cè)結(jié)果

120株鮑曼不動(dòng)桿菌中，改良CarbaNP陽(yáng)性64株，陰性56株;CIM法陽(yáng)性66株，陰性54株。100株銅綠假單胞菌中，改良CarbaNP陽(yáng)性55株，陰性45株;CIM法陽(yáng)性56株，陰性44株。

2.4 改良CarbaNP法和CIM法在鮑曼不動(dòng)桿菌中的檢測(cè)效能比較

在鮑曼不動(dòng)桿菌中，OXA-23基因攜帶率為94.59%（70/74），以其為標(biāo)準(zhǔn)，在檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥方面上，基因檢測(cè)法與改良CarbaNP法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 2.736，P = 0.098）。見(jiàn)表2?；驒z測(cè)法與CIM法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 2.551，P = 0.110）。見(jiàn)表3。改良CarbaNP法和CIM法分別與基因檢測(cè)結(jié)果比較，CIM法的敏感性（90.74%，49/54）和特異性（98.48%，65/66）均略高于改良CarbaNP法的敏感性（83.93%，47/56）和特異性（95.31%，61/64），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 1.149， P = 0.284;χ2 = 1.096，P = 0.295）。見(jiàn)表2～3。

2.5 改良CarbaNP法和CIM法在銅綠假單胞菌中的檢測(cè)效能比較

在銅綠假單胞菌中，VIM-1陽(yáng)性攜帶率為93.33%（56/60），以其為標(biāo)準(zhǔn)，在檢測(cè)銅綠假單胞菌碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥方面上，基因檢測(cè)法與改良CarbaNP法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 0.364，P = 0.546）。見(jiàn)表4?；驒z測(cè)法與CIM法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 0.324，P = 0.569）。見(jiàn)表5。改良CarbaNP法和CIM法分別與基因檢測(cè)結(jié)果比較，CIM法的敏感性（95.56%，43/45）和特異性（98.18%，54/55）均略高于改良CarbaNP法的敏感性（86.96%，40/46）和特異性（92.59%，50/54），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 3.751，P = 0.053;χ2 = 1.945，P = 0.163）。見(jiàn)表4～5。

3 討論

近年，鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌分離率呈上升趨勢(shì)，多見(jiàn)于有基礎(chǔ)疾病、有重大外科手術(shù)史或長(zhǎng)期住院患者，不利于疾病的恢復(fù)及預(yù)后[13]。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，院內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌感染可明顯提高患者死亡率，可高達(dá)40%，并與多重耐藥相關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制主要包括產(chǎn)碳青霉烯酶、外膜孔蛋白通透性下降，外排泵的過(guò)度表達(dá)和藥物作用靶位改變3種，前者是其主要機(jī)制[15]。碳青霉烯酶是指能夠明顯水解至少一類(lèi)-β內(nèi)酰胺酶（亞胺培南或美羅培南），主要由碳青霉烯酶編碼基因決定，根據(jù)Amble分子分類(lèi)法，將其分為絲氨酸酶-A類(lèi)，包括KPC，金屬酶-B類(lèi)，包括VIM和IMP和D類(lèi)，包括OXA[16]。研究發(fā)現(xiàn)，D類(lèi)的水解作用是鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯類(lèi)的最重要原因，尤以O(shè)XA-23多見(jiàn)[17]。而IMP和VIM在銅綠假單胞菌中常見(jiàn)[18]。本研究選取KPC、GES、IMP、VIM與OXA-23作為鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶檢測(cè)基因，選取VIM-1、IMP-4、KPC-2和NDM-1作為銅綠假單胞菌碳青霉烯酶檢測(cè)基因，發(fā)現(xiàn)OXA-23基因攜帶率為94.59%，VIM-1基因攜帶率為93.33%，與前述結(jié)論基本一致，并作為本研究鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌碳青霉烯酶耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)，而其他鮑曼不動(dòng)桿菌雖表現(xiàn)為碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥，但其耐藥基因表型不是D類(lèi)，可能是由其他機(jī)制介導(dǎo)。

鑒于臨床鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌感染的嚴(yán)峻形勢(shì)，2015年CLSICarba NP試驗(yàn)作為碳青霉烯酶的生化檢測(cè)方法，多用于流行病學(xué)調(diào)查和感染控制，并展現(xiàn)了其在腸桿菌和綠膿種的價(jià)值，但對(duì)不動(dòng)桿菌產(chǎn)生的大量D類(lèi)碳青霉烯酶不敏感，與蛋白抽提液有關(guān)，改良CarbaNP法則用高滲5 mol/L NaCl取代蛋白抽提液，使細(xì)菌完全溶解，菌量和酶釋放量明顯增加[19-23]。CIM法是由Kim van der Zwaluw等研究的一種新型碳青霉烯酶表型檢測(cè)方法，目前在對(duì)VIM、IMP、OXA-23、KPC、NDM和OXA-48基因介導(dǎo)的碳青霉烯酶耐藥與基因檢測(cè)結(jié)果符合率基本一致[24]。在本研究鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌碳青霉烯酶檢測(cè)中，改良CarbaNP法與基因檢測(cè)法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），CIM法和基因檢測(cè)法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），提示改良CarbaNP法和CIM法在鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌碳青霉烯酶檢測(cè)中均具有一定價(jià)值，與前述結(jié)論基本一致。但本研究還發(fā)現(xiàn)，CIM法敏感性和特異性均略高于改良CarbaNP法，提示CIM法在鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌碳青霉烯酶檢測(cè)中優(yōu)于改良CarbaNP法，但本研究標(biāo)本量有限，暫未發(fā)現(xiàn)其顯著性差異，后續(xù)可繼續(xù)探討。

綜上認(rèn)為，改良CarbaNP法和CIM法在鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類(lèi)抗生素快速檢測(cè)中均具有一定價(jià)值，以后者檢測(cè)效能較好。

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