李家立 王亮 白艷香

[摘要] 目的 觀察功能性腹瀉脾虛證模型大鼠腸組織NHE3、Na+-K+-ATPase、ENaC等離子通道蛋白的表達變化。 方法 采用隨機數(shù)字表法將24只3周齡雄性Wistar大鼠分為正常組和模型組，利用小平臺站立法聯(lián)合高乳糖飼料喂養(yǎng)建立功能性腹瀉脾虛證模型，造模14 d后取材，采用Western blot檢測腸組織中的各指標蛋白表達變化。 結(jié)果 造模后1 d，兩組大鼠體重均顯著重于造模前1 d（P < 0.01），但模型組顯著輕于正常組（P < 0.01）。模型組大鼠腹瀉率為100%。造模后，模型組大鼠結(jié)腸NHE3、Na+-K+-ATPase相對表達量均低于正常組（P < 0.05或P < 0.01），NHERF2、PKAR2相對表達量均高于正常組（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 Na+-K+-ATPase、NHE3等Na+通道蛋白的表達下調(diào)可能是功能性腹瀉脾虛證發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，值得進一步研究證實。

[關(guān)鍵詞] 腹瀉;脾虛;Na+通道;NHE3;Na+-K+-ATPase

[中圖分類號] R-332 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）06（a）-0008-04

[Abstract] Objective To observe the changes of NHE3， Na+-K+-ATPase and ENaC in intestine of functional diarrhea model rats with spleen deficiency. Methods Twenty-four male Wistar rats （3 weeks old） were divided into normal group and model group according to the random number table method. The model rats of functional diarrhea with spleen deficiency syndrome were made using the modified multiple platform method and high lactose feed. After the model was made， the materials were taken and the expression of various indexes in intestinal tissue was detected by Western blot. Results The first day after molding， the weight of rats in both groups was significantly heavier than that in the first day before modeling （P < 0.01）， but the weight of rats in model group was significantly lighter than that in normal group （P < 0.01）. The diarrhea rate of rats in model group was 100%. After molding， the relative expression of NHE3 and Na+-K+-ATPase in colon of model group was lower than that of normal group （P < 0.05 or P < 0.01）， the relative expression of NHERF2 and PKAR2 in colon of model group was higher than that of normal group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion The down-regulation of Na+-K+-ATPase， NHE3 and other sodium channel proteins may be the molecular biological basis of spleen deficiency syndrome of functional diarrhea， which is worth further study and confirmation.?

[Key words] Diarrhea; Spleen deficiency; Sodium channel; NHE3; Na+-K+-ATPase

功能性腹瀉是極其常見的消化系統(tǒng)疾病，近年來隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變、社會節(jié)奏的加快，功能性腹瀉脾虛證的發(fā)病率不斷升高。腹瀉是胃腸道對水和電解質(zhì)分泌吸收的正常生理平衡被打破的結(jié)果，而Na+是維持組織液、血漿滲透壓、腸黏膜內(nèi)外水電解質(zhì)平衡的關(guān)鍵因素。腸道對電解質(zhì)的吸收，主要是建立在對Na+的吸收基礎(chǔ)上，而對水溶性有機物質(zhì)的吸收也基本上都是與Na+相偶聯(lián)。因此，Na+的吸收狀態(tài)直接影響腸道對于其他電解質(zhì)、有機溶質(zhì)的吸收情況;Na+吸收障礙會造成腸道滲透壓升高，進而導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。本實驗利用小平臺聯(lián)合高乳糖飼料喂養(yǎng)建立功能性腹瀉脾虛證模型[1]，觀察脾虛腹瀉模型大鼠腸組織中不同Na+通道蛋白表達變化。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 ?雄性Wistar大鼠（3周齡），24只，體重54.9～64.0 g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于濟寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境：光照周期12 h/12 h，室溫22～25℃，相對濕度45%～60%，自由進食、飲水。倫理批號：2018-FY-012（濟寧醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會）。

1.1.2 實驗試劑 ?兔抗大鼠NHE3多克隆抗體（Abcam公司，ab95299）;兔抗大鼠NHERF1多克隆抗體（Abcam公司，ab3452）;兔抗大鼠NHERF2多克隆抗體（Invitrogen公司，PA5-50067）;兔抗大鼠PKAR2多克隆抗體（Abcam公司，ab38949）;兔抗大鼠Na+-K+-ATPase多克隆抗體（CST公司，3010S）;兔抗大鼠ENaC-γ多克隆抗體（Abcam公司，ab3468）;兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（Bioswamp公司，PAB36269）;山羊抗兔IgG（Bioswamp公司，SAB43714）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）（Bioswamp，W1712）;蛋白質(zhì)Marker（Thermo，26634）。

1.1.3 實驗儀器 ?電泳儀（BIO-RAD，mini protean 3 cell）;酶標儀（芬蘭雷勃，MK3）;干式恒溫器（杭州爽盛儀器，K30）;離心機（杭州奧盛，Icen-24R）;水浴鍋（Leica，HI1210）;全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能，Tanon-5200）。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 ?用高乳糖飼料喂養(yǎng)幼齡Wistar大鼠14 d;每日22：00至次日7：00將大鼠放置在特制方形箱體水槽中的小平臺上，箱體水槽大小為112 cm×62 cm×41 cm，箱內(nèi)共設(shè)置15個圓形小平臺，每個小平臺臺面直徑8 cm，柱高10 cm;平臺周邊注水，水深1.5 cm，水溫維持在（22±2）℃;大鼠在平臺上可以自由活動，而一旦大鼠進入睡眠狀態(tài)則會因為肌肉舒張、松弛而落入水中，不得休息，以此建立脾虛腹瀉模型[1-3]。見圖1。

1.2.2 實驗分組 ?采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組，每組12只，共24只。正常組：同期正常飼養(yǎng)。模型組：高乳糖飼料喂養(yǎng)，每日22：00至次日7：00置入水環(huán)境小平臺站立，持續(xù)14 d。

1.2.3 實驗取材 ?造模14 d后，按每10毫升每千克體重大鼠給予4%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血，低溫靜置2 h后，4℃ 3000 r/min離心15 min，離心半徑為10 cm，取上清。取血后即刻斷頭處死，冰上取腸組織，結(jié)腸至肛門向上2 cm開始，取結(jié)腸4 cm，用生理鹽水將腸內(nèi)容物清洗干凈后，再分別放入福爾馬林固定液或液氮中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.2.4 蛋白表達檢測 ?采用Western blot檢測各個觀察指標的表達變化，將組織剪成細小的碎片后，進行蛋白抽提，BCA法蛋白定量，將制備好的蛋白樣本經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h（或4℃過夜），按各指標說明書（稀釋比例：NHE3、PKAR2、Na+-K+-ATPase、ENaC-γ、GAPDH為1∶1000;NHERF1、NHERF2為1∶2000）稀釋抗體后，加入一抗室溫孵育1 h（或4℃過夜），PBST洗脫后二抗室溫孵育1 h（或4℃過夜），PBST洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。最后將膜置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測，通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠造模前后體重比較

造模前1 d，兩組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）;造模后1 d，兩組大鼠體重均顯著重于造模前1 d（P < 0.01），但模型組顯著輕于正常組（P < 0.01）。見表1。

2.2 兩組大鼠造模前后糞便情況比較

造模前，兩組大鼠的糞便均為顆粒樣大便;造模后，同期飼養(yǎng)的正常組大鼠的糞便為顆粒樣大便，模型組大鼠的糞便為黃色稀便;造模操作使模型組大鼠出現(xiàn)明顯腹瀉情況，且腹瀉率為100%。見圖2。

2.3 兩組大鼠結(jié)腸組織各觀察指標蛋白相對表達量比較

造模后，模型組大鼠結(jié)腸NHE3、Na+-K+-ATPase相對表達量均低于正常組（P < 0.05或P < 0.01），NHERF2、PKAR2相對表達量均高于正常組（P < 0.05或P < 0.01）。見圖3。

3 討論

利用小平臺站立法聯(lián)合高乳糖飼料喂養(yǎng)制作的功能性腹瀉脾虛證模型大鼠，其體重增長趨勢緩慢，毛色枯槁，精神倦怠，便溏泄瀉，腸吸收功能減退[4-6]。其中腹瀉是該模型的典型癥狀，本研究采用此模型大鼠探討脾虛泄瀉腸組織中Na+通道蛋白的變化。

Na+是維持組織液、血漿滲透壓的重要組成部分，Na+的吸收狀態(tài)直接影響腸道對于其他電解質(zhì)、有機溶質(zhì)的吸收情況;Na+吸收障礙會造成腸道滲透壓升高，導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。腸細胞對Na+的吸收主要有三種方式[7]：①以ENaC為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的Na+生電性非偶聯(lián)吸收;②以NHE為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的電中性的NaCl吸收[8];③Na+與有機溶質(zhì)的偶聯(lián)吸收，主要是以SGLT為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的Na+與葡萄糖的偶聯(lián)吸收[9]。本研究主要觀察前兩種方式。Na+的非偶聯(lián)吸收，是通過細胞腔面膜的ENaC，順化學(xué)梯度進入細胞內(nèi)，再由基底膜鈉鉀泵（Na+-K+-ATPase）泵出細胞外。Na+-K+-ATPase對Na+的主動運輸，使細胞內(nèi)Na+濃度維持在較低水平，為Na+及其他電解質(zhì)等進出細胞提供電化學(xué)梯度，對于維持水鈉平衡、血容量及血壓起重要作用。本研究中模型組大鼠結(jié)腸組織中的Na+-K+-ATPase較正常組大鼠表達下降，會導(dǎo)致結(jié)腸黏膜組織的能量代謝異常、Na+泵出細胞外障礙，使大量Na+滯留在細胞內(nèi)，引起細胞腫脹，細胞正常的生理功能受到抑制，腸道對水的吸收能力也顯著下降，可能是脾虛泄瀉的微觀表現(xiàn)之一。另外Na+-K+-ATPase表達減少，細胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度變化可能會影響胃腸平滑肌細胞的動作電位以及細胞內(nèi)Ca2+的濃度，也可能會導(dǎo)致胃腸道動力紊亂[10]。Na+-K+-ATPase已被諸多進行中醫(yī)脾虛證研究的學(xué)者關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，在脾虛狀態(tài)下大鼠細胞能量代謝障礙[11]，Na+-K+-ATPase活性降低[12]，回腸結(jié)腸組織Na+-K+-ATPase活性下降[13]，認為Na+-K+-ATPase活性下降可能是脾虛證的病理機制之一。很多中藥[14-15]、方劑[16-17]也是通過作用于Na+-K+-ATPase發(fā)揮對脾胃的調(diào)節(jié)作用。

電中性的NaCl吸收，是Na+和Cl-的偶聯(lián)吸收過程，包括了Na+-H+交換與Cl--HCO-3交換兩種逆向轉(zhuǎn)運。Na+-H+交換依賴于腸道中的多種Na+/H+交換體，其中NHE3更多地參與腸上皮細胞對Na+的吸收[8]。有研究[18]發(fā)現(xiàn)，NHERF在小腸對Na+的吸收方面發(fā)揮重要作用，NHERF對NHE的調(diào)節(jié)直接或間接地導(dǎo)致了腹瀉的發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示，小平臺站立聯(lián)合高乳糖喂養(yǎng)造模后，出現(xiàn)脾虛泄瀉的大鼠腸組織中NHERF2表達升高，PKAR2表達升高，NHE3表達下降。筆者推測，NHERF2通過PKAR2對NHE3產(chǎn)生抑制效應(yīng)，NHE3表達下調(diào)，造成Na+吸收減少而產(chǎn)生腹瀉，可能是脾虛泄瀉發(fā)生的分子機制。

綜上所述，Na+吸收的正常與否在腹瀉的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮十分重要的作用，Na+-K+-ATPase、NHE3等Na+通道蛋白的表達下調(diào)可能是功能性腹瀉脾虛證發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，值得進一步研究證實。

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（收稿日期：2019-12-12 ?本文編輯：李亞聰）