張曦倩　姚俐　羅燕群　易艷紅　董梅　劉風(fēng)華

【摘要】目的 觀察木犀草素對雙酚A誘導(dǎo)的小鼠卵巢毒性的緩解作用及初步探索p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）是否參與其中。方法 32只昆明小鼠隨機(jī)分為正常對照組、雙酚A組、雙酚A和木犀草素共處理組（共處理組）、木犀草素組，每組各8只，其中雙酚A組以10 mg/（kg·d）的雙酚A溶劑灌胃，共處理組依次以10 mg/（kg·d）的木犀草素溶劑和10 mg/（kg·d）的雙酚A溶劑灌胃，木犀草素組以10 mg/（kg·d）的木犀草素溶劑灌胃，正常對照組以等體積玉米油灌胃;給藥均持續(xù)4周。給藥結(jié)束后取小鼠卵巢組織，檢測各組小鼠卵巢組織中丙二醛水平、超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化氫酶（CAT）活性的變化，并檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的活化片段（cleaved Caspase-3）、磷酸化p38 MAPK、磷酸化ERK蛋白表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)雙酚A處理后，小鼠卵巢組織丙二醛水平升高（P < 0.05）、SOD和CAT活性降低（P < 0.05）、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量升高（P < 0.05）、p38 MAPK和ERK的磷酸化水平升高（P < 0.05）;與雙酚A單獨(dú)處理相比，木犀草素與雙酚A共處理后小鼠卵巢組織丙二醛水平降低（P < 0.05）、SOD和CAT活性增高（P < 0.05）、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量降低（P < 0.05）、而磷酸化p38 MAPK和ERK蛋白相對表達(dá)量降低（P < 0.05）。木犀草素組與正常對照組各項(xiàng)指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。結(jié)論 木犀草素可有效緩解雙酚A誘導(dǎo)的小鼠卵巢毒性作用，其可能與p38 MAPK和ERK信號通路的參與有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】木犀草素;雙酚A;細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶;p38絲裂原活化蛋白激酶;氧化損傷

【Abstract】Objective To evaluate the alleviating effect of luteolin on bisphenol A-induced ovarian toxicity in mouse models and to explore whether p 38 mitogen-activated protein kinase （p38 MAPK） and extracellular regulatory kinase （ERK） are involved in this process. Methods Thirty-two Kunming mice were randomly divided into 4 groups with 8 mice in each group： negative control group （NC）， bisphenol A group （BPA）， bisphenol A and luteolin co-treatment group （BPA+Lut）， and luteolin group （Lut）， respectively. The mice in the BPA group were administrated with? BPA solvent at a dose of 10 mg/（kg·d）， those in the BPA + Lut group were treated with 10 mg/（kg·d） luteolin solvent and 10 mg/（kg·d） BPA solvent in sequence， animals in the Lut group were administrated with 10 mg/（kg·d） luteolin solution and those in the negative control group were given with an equal volume of corn oil. The above drugs were administered by daily gavage for 4 consecutive weeks. After corresponding administrations， the ovarian tissues were collected. The changes in the activity of malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） were observed. The expression levels of apoptosis-related protein cleaved Caspase-3 （cleaved Caspase-3）， phosphorylated p38 MAPK and ERK proteins were quantitatively measured. Results MDA levels in the ovarian tissues were significantly increased after BPA treatment （P < 0.05）， while SOD and CAT activities were markedly reduced （both P < 0.05）. The expression level of cleaved Caspase-3 protein was significantly up-regulated （P < 0.05）， p38 MAPK and ERK phosphorylation levels were also significantly increased （both P < 0.05）. Compared with BPA treatment alone， co-treatment with luteolin and BPA significantly reduced the MDA levels （P < 0.05）， elevated the SOD and CAT activities （both P < 0.05）， and down-regulated the relative expression levels of cleaved Caspase-3， phosphorylated p38 MAPK and ERK proteins （all P < 0.05）. There was no significant difference between Lut and NC （all P > 0.05）. Conclusion Luteolin can effectively alleviate BPA-induced ovarian toxicity in mouse models， which is probably correlated with the involvement of p38 MAPK and ERK signaling pathways.

【Key words】Luteolin;Bisphenol A;Extracellular regulatory kinase;p38 mitogen-activated protein kinase;Oxidative damage

雙酚A是人們?nèi)粘Ｉ钪休^常接觸到的化學(xué)物質(zhì)之一。長期攝入雙酚A具有明顯的卵巢毒性，其導(dǎo)致的卵巢組織氧化損傷可能在生殖功能障礙性疾病中起著重要作用[1]。有研究顯示，雙酚A亞慢性暴露損傷雌性小鼠卵巢儲備功能[2]。因此，積極探索能有效緩解雙酚A蓄積所致的氧化應(yīng)激損傷、抑制卵巢組織凋亡進(jìn)而改善卵巢功能的新策略具有重大意義。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用[3]。有關(guān)卵巢癌的研究顯示，木犀草素可調(diào)控氧化應(yīng)激水平和細(xì)胞凋亡[4]。本研究以雙酚A干預(yù)昆明小鼠建立卵巢氧化損傷模型，觀察木犀草素對雙酚A誘導(dǎo)的小鼠卵巢組織氧化損傷的緩解作用，并初步探討p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）是否參與其中。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

選用6 ～ 8周齡的無特定病原體（SPF）級雌性昆明種（KM）小鼠 32只（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），體質(zhì)量（20.1±2.2）g。將小鼠飼養(yǎng)在SPF動物室中，自然晝夜光線照明，保持良好的室內(nèi)通風(fēng)，相對濕度40% ～ 70%，室溫（22±2）℃，光暗周期為12 h，飲食自取，喂飼普通飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理過程中，嚴(yán)格遵守3R原則，善待實(shí)驗(yàn)動物，保障動物福利，確保動物享有不受饑渴、生活舒適等五大自由，動物實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，動物處死采用人道方法實(shí)施安死術(shù)。

二、主要試劑與儀器

雙酚A（分子式C15H16O2，分子量228.29，純度99%）、木犀草素（分子式C15H10O6，分子量286.24，純度98%）購自美國Sigma公司。丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、RIPA細(xì)胞蛋白提取液、抗體稀釋液購自江蘇碧云天生物有限公司。凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的活化片段（cleaved Caspase-3）一抗、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）、磷酸化ERK（p-ERK）、GAPDH一抗及相應(yīng)二抗購自美國CST公司。其他實(shí)驗(yàn)常用試劑購自廣州永津生物有限公司。多功能酶標(biāo)儀為美國Spectramax M5型。蛋白免疫印跡電泳儀、電轉(zhuǎn)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

三、動物模型的制備與給藥

根據(jù)文獻(xiàn)[5]，長期攝入10 mg/（kg·d）劑量的雙酚A可引起大鼠生殖系統(tǒng)功能損傷、過氧化應(yīng)激等，因此本研究以10 mg/（kg·d）的雙酚A作為暴露劑量。另根據(jù)既往研究，木犀草素在劑量為10 mg/（kg·d）時具有抗氧化、抗凋亡作用，劑量高達(dá)100 mg/（kg·d）也較為安全[6-7]。因此本研究設(shè)定木犀草素劑量為10 mg/（kg·d）。雙酚A和木犀草素均以玉米油配制溶劑。

將32只小鼠編號，根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法分為正常對照組、雙酚A組、雙酚A+木犀草素組（共處理組）以及木犀草素組，每組各8只。其中雙酚A組以10 mg/（kg·d）雙酚A溶劑灌胃，共處理組依次以10 mg/（kg·d）的木犀草素溶劑和10 mg/（kg·d）的雙酚A溶劑灌胃，木犀草素組以10 mg/（kg·d）的木犀草素溶劑灌胃，正常對照組以等體積玉米油灌胃。以上4組給藥均持續(xù)4周。

四、標(biāo)本采集

于最后1次灌胃給藥24 h后，頸椎脫臼法處死小鼠，分離雙側(cè)卵巢，快速置入液氮保存，用于丙二醛、SOD、CAT和蛋白免疫印跡法檢測。

五、小鼠卵巢組織丙二醛、SOD、CAT檢測

檢測步驟參考試劑盒說明書：及時取出上述超低溫凍存的各組小鼠卵巢組織，迅速剪碎研磨后以預(yù)冷的生理鹽水一同在冰浴中勻漿（生理鹽水體積∶組織質(zhì)量= 9∶1），置于EP管中以2000轉(zhuǎn)/分離心8 min，取適量上清液，根據(jù)說明書于酶標(biāo)儀上測定丙二醛的含量及SOD、CAT的活性。

六、小鼠卵巢組織cleaved Caspase-3、p-p38 MAPK、p-ERK蛋白檢測

采用蛋白免疫印跡法：各組小鼠卵巢組織剪碎勻漿后，二喹啉甲酸（BCA）法行蛋白定量，每組各取30 μg蛋白液，行10% SDS-Page凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入一抗cleaved Caspase-3（1∶1000）、p-ERK（1∶1000）、p-p38 MAPK（1∶1000）、GAPDH（1∶2000），4℃孵育過夜，加入相應(yīng)二抗（1∶2000），室溫孵育1 h后行發(fā)光顯影，采用Image J分析條帶灰度值。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，雙酚A組、木犀草素組與正常對照組及雙酚A組和共處理組的組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、各組小鼠卵巢組織的丙二醛水平及SOD、CAT的活性分析

雙酚A組小鼠卵巢組織丙二醛水平為（15.23 ±2.92）nmol/mgprot高于正常對照組的（4.18±0.61） nmol/mgprot（LSD-t = 8.282，P < 0.05），而共處理組小鼠卵巢組織丙二醛水平為（8.50±1.40）nmol/mgprot低于雙酚A組（LSD-t = 4.666，P < 0.05）。雙酚A組小鼠卵巢組織SOD活性為（95.34±15.84） nmol/mgprot，低于正常對照組的（210.34±41.09）nmol/mgprot（LSD-t = 5.839，P < 0.05），而共處理組的小鼠卵巢組織SOD活性為（159.65±13.77）nmol/mgprot，比雙酚A組改善（LSD-t = 6.851，P < 0.05）。雙酚A組小鼠卵巢組織CAT活性為（7.78± 1.30）nmol/mgprot低于正常對照組的（20.70±3.10）nmol/mgprot（LSD-t = 8.594，P < 0.05），而共處理組

的小鼠卵巢組織CAT活性為（15.43±1.60）nmol/mgprot，比雙酚A組改善（LSD-t = 8.298，P < 0.05）。木犀草素組與正常對照組小鼠卵巢組織的丙二醛水平和SOD、CAT活性比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見圖1。

二、各組小鼠卵巢組織cleaved Caspase-3、p-p38 MAPK、p-ERK蛋白相對表達(dá)量的比較

雙酚A組小鼠卵巢組織cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量為（151.54±14.00）%，高于正常對照組的（100.00±15.01）%（LSD-t = 4.351，P < 0.05），而共處理組的cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量為（68.88±9.00）%，低于雙酚A組（LSD-t = 3.102，P < 0.05）。雙酚A組卵巢組織p-p38 MAPK水平為（142.05±18.00）%，高于正常對照組的（100.00 ±11.00）%（LSD-t = 3.453，P < 0.05），而共處理組的p-p38 MAPK水平為（101.05±9.00）%，低于雙酚A組（LSD-t = 3.475，P < 0.05）。雙酚A組小鼠卵巢組織p-ERK水平為（991.63±141.01%），高于正常對照組的（100.00±12.00）%（LSD-t =

10.910，P < 0.05），而共處理組小鼠卵巢組織p-ERK水平為（674.13±48.00）%，低于雙酚A組（LSD-t = 3.692，P < 0.05），木犀草素組與正常對照組小鼠卵巢組織的cleaved Caspase-3、p-p38 MAPK、p-ERK蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見圖2。

討論

雙酚A被廣泛應(yīng)用于聚碳酸酯塑料、聚氯乙烯塑料、食品容器、牙科材料、紙制品、玩具、奶嘴等產(chǎn)品的制作，人們可通過呼吸、皮膚黏膜接觸等途徑攝入雙酚A。流行病學(xué)證據(jù)表明，高達(dá)93%人群的尿液或血清中可以檢測到雙酚A[8]。由于雙酚A存在內(nèi)分泌干擾作用，流行病學(xué)研究顯示雙酚A與子宮內(nèi)膜異位等生殖內(nèi)分泌疾病有關(guān)[9]。雙酚A除具有內(nèi)分泌干擾作用外，其慢性蓄積后組織中的活性氧水平升高、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)結(jié)構(gòu)不同程度遭到破壞，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。超氧化物、過氧化氫和羥基自由基等可引起卵巢組織膜脂質(zhì)的氧化損傷，并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，在機(jī)體內(nèi)可導(dǎo)致凋亡和氧化應(yīng)激壞死等病理事件[10]。氧自由基攻擊脂質(zhì)的不飽和脂肪酸引起脂質(zhì)過氧化損傷，生成一系列毒性化合物，其中就包括丙二醛，丙二醛是氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要生物標(biāo)記之一，其可引起細(xì)胞膜損害，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變甚至細(xì)胞死亡。SOD和CAT是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力的可靠指標(biāo)[11]。有研究者報(bào)道，雙酚A處理后的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞活力呈劑量依賴性降低、活性氧水平升高、 SOD活性明顯降低[12]。雙酚A暴露抑制F1雌性小鼠的卵巢發(fā)育，升高卵巢組織凋亡相關(guān)蛋白Caspase家族及Bax的相對表達(dá)[13]。本研究用雙酚A誘導(dǎo)昆明小鼠，結(jié)果顯示小鼠卵巢組織中脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛升高，抗氧化酶SOD和CAT降低，表明雙酚A暴露可誘導(dǎo)小鼠卵巢組織氧化損傷。此外，雙酚A干預(yù)后的小鼠卵巢組織中凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3表達(dá)升高，提示雙酚A可誘導(dǎo)小鼠卵巢組織凋亡事件的發(fā)生。

MAPK信號通路廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)各種生物活動，對各種刺激信號有著重要的傳導(dǎo)功能，如增殖、分化、存活、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，在腫瘤和生殖內(nèi)分泌疾病等病理或疾病中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[14]。有研究顯示，雙酚A的衍生物雙酚芴誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞DNA損傷、線粒體功能障礙以及凋亡相關(guān)基因表達(dá)升高，其與MAPK信號通路參與其中有關(guān)[15]。本研究中，雙酚A干預(yù)昆明小鼠提高卵巢組織氧化損傷水平和凋亡水平的同時伴隨著p38 MAPK和ERK的磷酸化水平升高，表明p38 MAPK和ERK信號通路參與雙酚A誘導(dǎo)的卵巢毒性作用。

木犀草素在自然界中分布廣泛，研究發(fā)現(xiàn)金銀花、菊花、荊芥、黃岑屬、紫蘇屬等天然藥材中均含有木犀草素，其因具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用備受關(guān)注。研究表明，木犀草素可以通過多條細(xì)胞信號通路發(fā)揮其抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，包括MAPK、Akt、NF-κB等[16-17]。此外有研究顯示，木犀草素可通過降低ERK和黏附斑激酶的磷酸化水平抑制卵巢癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[18]。木犀草素還可通過降低ERK和p38 MAPK的磷酸化水平緩解脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞毒性作用[3]。本研究使用木犀草素與雙酚A共處理的小鼠與雙酚A單獨(dú)處理的小鼠相比，卵巢組織脂質(zhì)過氧化損傷指標(biāo)丙二醛含量下降，抗氧化酶SOD、CAT活性改善，而p38 MAPK和ERK的磷酸化水平降低，表明木犀草素可能通過調(diào)控p38和ERK信號通路抑制雙酚A誘導(dǎo)的卵巢毒性作用。另外，木犀草素組與正常對照組各項(xiàng)指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示木犀草素?zé)o明顯毒性。

然而，本研究目前只初步探討了木犀草素緩解雙酚A的卵巢毒性作用，并未在細(xì)胞水平和基因?qū)用嫔钊胩接懫淇寡趸?、抗凋亡的作用機(jī)制以及MAPK的調(diào)控機(jī)制，我們將在今后開展進(jìn)一步工作予以證實(shí)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Avci B， Bahadir A， Tuncel OK， Bilgici B. Influence of α-tocopherol and α-lipoic acid on bisphenol-A-induced oxidative damage in liver and ovarian tissue of rats. Toxicol Ind Health， 2016， 32（8）：1381-1390.

[2] 曹羽明，瞿鑫蘭，張銘，左馳，姚燕如，楊寒笑，張?jiān)?雙酚A亞慢性暴露對雌性小鼠卵巢儲備功能的影響.中國生育健康雜志，2017，28（3）：212-216.

[3] Fan S， Habib A， Liu J， Tan J. LED enhances anti-inflammatory effect of luteolin （3， 4， 5， 7-tetrahydroxyflavone） in vitro. Am J Transl Res， 2018， 10（1）：283-291.

[4] Tavsan Z， Kayali HA. Flavonoids showed anticancer effects on the ovarian cancer cells： involvement of reactive oxygen species， apoptosis， cell cycle and invasion. Biomed Pharmacother， 2019， 116：109004.

[5] Zaid SS， Othman S， Kassim NM. Potential protective effect of Tualang honey on BPA-induced ovarian toxicity in prepubertal rat. BMC Complement Altern Med， 2014， 14：509.

[6] Zhang M， He L， Liu J， Zhou L. Luteolin attenuates diabetic nephropathy through suppressing inflammatory response and oxidative stress by inhibiting STAT3 Pathway. Exp Clin Endocrinol Diabetes， 2020 Jan 2. doi： 10.1055/a-0998-7985. Epub ahead of print.

[7] Fu J， Sun H， Zhang Y， Xu W， Wang C， Fang Y， Zhao J. Neuroprotective effects of luteolin against spinal cord ischemia-reperfusion injury by attenuation of oxidative stress， inflam-mation， and apoptosis. J Med Food， 2018， 21（1）：13-20.

[8] Vandenberg LN， Hunt PA， Myers JP， Vom Saal FS. Human exposures to bisphenol A： mismatches between data and assumptions. Rev Environ Health， 2013， 28（1）：37-58.

[9] Moreira Fernandez MA， Cardeal ZL， Carneiro MM， André LC. Study of possible association between endometriosis and phthalate and bisphenol A by biomarkers analysis. J Pharm Biomed Anal， 2019， 172：238-242.

[10] Luderer U. Ovarian toxicity from reactive oxygen species. Vitam Horm， 2014， 94：99-127.

[11] Fang WL， Zhao DQ， Wang F， Li M， Fan SN， Liao W， Zheng YQ， Liao SW， Xiao SH， Luan P， Liu J. Neurotropin? alleviates hippocampal neuron damage through a HIF-1α/MAPK pathway. CNS Neurosci Ther， 2017， 23（5）：428-437.

[12] Lee CT， Wang JY， Chou KY， Hsu MI. 1，25-Dihydroxyvitamin D3 modulates the effects of sublethal BPA on mitochondrial function via activating PI3K-Akt pathway and 17β-estradiol secretion in rat granulosa cells. J Steroid Biochem Mol Biol， 2019， 185：200-211.

[13] Wei Y， Han C， Li S， Cui Y， Bao Y， Shi W. Maternal exposure to bisphenol A during pregnancy interferes ovaries development of F1 female mice. Theriogenology， 2020， 142：138-148.

[14] Kim EK， Choi EJ. Compromised MAPK signaling in human diseases： an update. Arch Toxicol， 2015， 89（6）：867-882.

[15] Jia Z， Wang H， Feng Z， Zhang S， Wang L， Zhang J， Liu Q， Zhao X， Feng D， Feng X. Fluorene-9-bisphenol exposure induces cytotoxicity in mouse oocytes and causes ovarian damage. Ecotoxicol Environ Saf， 2019， 180：168-178.

[16] Aziz N， Kim MY， Cho JY. Anti-inflammatory effects of luteolin： a review of in vitro， in vivo， and in silico studies. J Ethnophar-macol， 2018， 225：342-358.

[17] Lu X， Li Y， Li X， Aisa HA. Luteolin induces apoptosis in vitro through suppressing the MAPK and PI3K signaling pathways in gastric cancer. Oncol Lett， 2017， 14（2）：1993-2000.

[18] Dia VP， Pangloli P. Epithelial-to-mesenchymal transition in paclitaxel-resistant ovarian cancer cells is downregulated by luteolin. J Cell Physiol， 2017， 232（2）：391-401.

（收稿日期：2020-03-07）

（本文編輯：林燕薇）