王 俊,柯 珂,覃佑康,卓民權(quán),余超鵬,秦高雄

(1.廣西化工研究院有限公司，廣西 南寧 530001；2.廣西科學(xué)院，廣西 南寧 530001；3.廣西眾益生物科技有限公司，廣西 崇左 532100)

羊棲菜在分類學(xué)上隸屬褐藻門圓子綱墨角藻目馬尾藻科馬尾藻屬，別稱鹿角尖、羊奶子，日本稱其為“長壽菜”。馬尾藻含有人體所需的18種重要的氨基酸，富含對人體有益的多糖、蛋白質(zhì)和微量元素，在抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力、抗衰老、促進骨骼生長、降血糖、抗凝劑、抗病毒、抗衰老等方面有著至關(guān)重要的作用。但是日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)馬尾藻中重金屬的積累量，尤其是砷的含量比較高，所以食用前要做一定的預(yù)處理[1]。

本文就羊棲菜中多糖的提取及抗癌活性進行討論，期望在羊棲菜多糖的提取和抗癌機理的研究等方面提供一定的參考。

1 羊棲菜多糖

羊棲菜多糖主要包括海藻酸、褐藻多糖、褐藻淀粉、膳食纖維等。李生堯課題組[2]在人工培育羊棲菜的過程中發(fā)現(xiàn)，野生羊棲菜的褐藻膠、褐藻多糖膠、褐藻淀粉的含量，均高于人工培育的羊棲菜。羊棲菜多糖的水解產(chǎn)物可用氣相色譜法或高效液相色譜法進行檢測。已有研究證明，絲狀多糖包含巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖胺、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、古洛糖醛酸等[3]。近年來，甲基化反應(yīng)(改良的函森方法)與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)檢測糖鏈序列和多糖殘基，已成為最經(jīng)典、最有效的方法之一。已有課題組通過“部分降解-甲基化-氣相色譜-質(zhì)譜-核磁共振”過程，分析羊棲菜絲孢多糖的結(jié)構(gòu)[4-5]。糖苷鍵的構(gòu)型、支鏈的存在和單糖的比例，可以在早期通過高碘酸氧化或者史密斯降解等經(jīng)典方法完成。利用質(zhì)譜技術(shù)可以測定糖苷鍵的類型，在電噴霧電離(ESI)的負(fù)離子模式下，硫酸化的寡糖可以很容易地作為陰離子電離，因此可以用電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS)或電噴霧電離四極桿飛行時間質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS)法，分析糖苷鍵的類型和硫酸化寡糖的硫酸化位點。

海藻酸也稱為海藻酸鈉或海帶膠，是單體中唯一含有羧基的多糖，位于褐藻的細(xì)胞壁中或分泌至細(xì)胞外層。β-D-甘露糖醛酸(M)和C-5差向異構(gòu)體α-L-古洛糖醛酸(G)通過β-(1→4)/α-(1→4)糖苷，將海藻酸聚合為線性聚合物多糖[6]，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 海藻酸線性聚合物多糖

NMR實驗表明，海藻酸中M單元和G單元的排列方式并不唯一，M嵌段和G嵌段不是單一的存在方式，還有可能是MG單元交替排列形成的MG嵌段。過菲等人[7]通過熱水萃取從羊棲菜中獲得粗多糖，總提取率為16.2%，總多糖中的海藻酸含量為36.2%。進一步分離純化可得到藻酸鈉，M/G比為0.75。于廣利課題組對野生羊棲菜和培育羊棲菜的海藻酸含量進行了對比，發(fā)現(xiàn)野生羊棲菜的M/G比為0.95(1H-NMR法測定)，而人工培育的僅為0.38。鄒濤課題組[8]研究發(fā)現(xiàn)，野生羊棲菜的M/G比可以達到0.98。其中原因，可以歸結(jié)于羊棲菜的原料種類、生態(tài)環(huán)境和收獲季節(jié)的不同，使得兩種不同的糖醛酸具有不同的鍵和比例，從而對其生物特性產(chǎn)生很大的影響。除此之外，測定方法也會對結(jié)果造成影響。一般的測定方法有NMR光譜法、IR法、CD法和HPLC法等，不同的測定方法得到的實驗結(jié)果也有差異。海藻酸具有強水溶性，高穩(wěn)定性，無毒，較好的凝膠性質(zhì)、黏度和生物相容性等，這些理化特性使得海藻酸廣泛應(yīng)用于傷口敷料、藥物緩釋載體等制藥領(lǐng)域，或是食品添加劑等領(lǐng)域。

褐藻多糖也稱為硫酸化巖藻聚糖，是一種天然的水溶性硫酸化雜多糖，存在于褐藻的間質(zhì)組織或黏液基質(zhì)中。褐藻多糖的成分很復(fù)雜，核心結(jié)構(gòu)主要由巖藻糖、硫酸、半乳糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、糖醛酸等組成。目前僅發(fā)現(xiàn)了其高純度化合物的結(jié)構(gòu)，但巖藻聚糖的整體結(jié)構(gòu)仍不清楚。

寧亞凈[9]采用柱色譜法，從粗制的羊棲菜多糖中提取和純化褐藻多糖，獲得了主鏈通過L-巖藻糖與α-(1→3)糖苷鍵連接，并通過α-(1→4)糖苷鍵部分連接，可能在第2位或第4位上帶有1個或2個硫酸根的核心重復(fù)單元→3)-α-L-Fucp-(1 → 3，4)-α-L-Fucp-(2/4-OSO3?)-(1 → (圖 2)，由巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖組成。黃陳剛課題組[10-15]分離出巖藻多聚糖(SFPS65A)，占總糖的67.5%，硫酸基17.5%，糖醛酸41.1%，蛋白質(zhì)5.2%，分子量90 kDa。SFPS65由巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸組成，比例 為 19.23∶9.58∶6.64∶1∶6.52∶2.57。SFPS65A的主鏈由→ 3)-α-L-Fucp-(1→ 3，4)-β-L-Fucp-(1→的重復(fù)單元構(gòu)建。其他課題組也得到了不同的重復(fù)單元。在不同的提取條件和水解條件下，羊棲菜多糖片段的組成和結(jié)構(gòu)存在明顯差異。由于其純度高，研究者對該結(jié)構(gòu)進行了大量研究，確定其主要成分為巖藻糖和硫酸鹽基團，但是總體結(jié)構(gòu)尚不清楚。褐藻多糖的生物活性隨分子量、硫酸鹽含量和硫酸鹽位置等的不同而不同。

圖2 褐藻多糖的核心重復(fù)單元

褐藻淀粉是羊棲菜中的一種小分子中性多糖，也被稱為海帶多糖、海帶淀粉。它具有可溶形式和不溶形式，其功能類似于植物淀粉。張全斌課題組從粗制羊棲菜多糖中提取可溶性褐藻淀粉(HFS-1)，平均分子量為3600kDa，總提取效率為0.25%。甲基化分析結(jié)果表明，HFS-1由非還原性的末端吡喃葡萄糖(15.3%)、3聯(lián)β-D-吡喃葡萄糖(66.4%)、6聯(lián)β-D-吡喃葡萄糖(4.1%)及3、6聯(lián)等構(gòu)成β-D吡喃葡萄糖(14.2%)，該甲基化分析數(shù)據(jù)與NMR數(shù)據(jù)一致。 HFS-1的假想核心結(jié)構(gòu)如圖3所示。吳明江課題組[16]分離了褐藻淀粉(CSFP-3)，提取效率約為0.70%，分子量小于3500 kDa。CSFP-3的組成主要是葡萄糖(57.7%)、巖藻糖(30.0%)和半乳糖(12.3%)。

圖3 褐藻淀粉的核心重復(fù)單元

羊棲菜富含膳食纖維。Lahaye[17]從羊棲菜中提取了膳食纖維，總量約為49.2%。張燕平等人[18]通過酶水解、酸和堿處理，從羊棲菜中純化了高活性膳食纖維，總收率為26.7%。

2 羊棲菜的提取

褐藻多糖在羊棲菜絲藻多糖中具有最大的藥理活性，粗多糖還含有大量的藻酸。褐藻多糖可溶于水，而藻酸不溶于水，所以從藻酸中分離褐藻糖膠，是提取褐藻多糖的重要步驟。水提取或酒精提取是羊棲菜多糖提取的常用方法，但提取時間長且產(chǎn)率較低。張銳等人[19]在提取過程中加入稀鹽酸，在一定程度上提高了提取率。徐杰等人采用稀酸提取和乙醇沉淀的方法，得到羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯粗品，隨著洗脫鹽濃度的增加，硫酸鹽基團的數(shù)量增加，而糖醛酸的數(shù)量逐漸減少。值得注意的是，稀酸和稀堿在一定程度上可以提高多糖的提取率，但也會使其硫酸鹽分解，進而破壞具有藥理活性的多糖結(jié)構(gòu)。寧亞凈在85℃下采用固液比為1∶30的熱水提取方法，對羊棲菜進行了2次提取(每次提取3h)。具體過程如下：在回流下用95%乙醇脫脂后，再用85℃的熱水萃取3次。過濾后將其混合并濃縮，并使用80%乙醇分離沉淀物。過濾并干燥后，最終獲得粗羊棲菜多糖，總提取率為20.4%。李亞娜等人[20]在提取溫度為85℃時，得到的羊棲菜多糖的提取率為11.12 %。倪順等人[21]同樣利用響應(yīng)面法研究了水提取羊棲菜多糖的最佳工藝：羊棲菜粉末→熱水浸提→浸提液→離心→上清液→真空濃縮→無水乙醇醇析→冷凍離心→醇沉物→干燥→粗多糖，此時的提取溫度為87℃，過高的溫度(超過100℃)會使多糖降解，適宜的提取溫度為80～90℃。丁浩淼等人[22]采用循環(huán)超聲法提取羊棲菜多糖，提取率為10.54%。宋偉康等人[23]根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計，考察液料比、提取時間、提取溫度3個工藝條件，確定了超聲波輔助稀堿提取多糖的最佳工藝參數(shù)為：液料比48.56∶1、提取時間5.78h、提取溫度70.91℃。與水提取相比，超聲提取所需的時間更短，提取效率更高，所提取多糖的抗氧化性更好。劉洪超等人[24]探索了微波輔助水提法提取羊棲菜多糖的較優(yōu)工藝條件，微波可以有效破壞細(xì)胞壁，使胞內(nèi)的多糖流出，此時得到的多糖具有良好的抗氧化活性。還可以利用酶解法提取，多糖中的蛋白質(zhì)可以通過Sevage方法或3%三氟乙酸(TFA))方法去除，其他小分子物質(zhì)可以通過透析或超濾去除。張華芳等人[25]利用正交實驗法，確定了酶解法的最佳酶量和提取溫度。黃惠琴課題組[26]通過響應(yīng)面法得到褐藻膠裂解酶的最適溫度為50℃，中性環(huán)境下穩(wěn)定，Ca2+、Mg2+和Fe2+等離子對裂解酶有促進作用，而EDTA、Ba2+、Zn2+等離子起抑制作用，為褐藻寡糖的酶解法規(guī)模制備提供了理論依據(jù)與應(yīng)用參考。

提取過程中加入高濃度乙醇溶液，可以減少色素、脂質(zhì)和固醇的溶解。可以采用蒽酮-硫酸法、間羥基聯(lián)苯法、考馬斯亮藍法和硫酸鋇比濁法，分別測量總多糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、硫酸根的含量。

目前，應(yīng)用最廣泛的多糖分離和純化的方法是柱色譜法，可以根據(jù)多糖的極性進行分離，酸性或中性組分通過DEAE-Sepharose CL-6B、DEAE-纖維素陰離子交換、DEAE-52陰離子交換得到分離，然后依據(jù)分子量的不同，通過sephadex-G系列和sephacryl-S系列得到分離，也可以通過Sephacryl S-300HR分離多糖，然后用Sephadex G-10(2種不同的凝膠過濾色譜法)洗脫。

3 藥理活性

目前的報道指出，褐藻多聚糖是馬尾藻中最具藥理活性的成分，尤其是硫酸化多糖。已有研究證實，褐藻多糖在抗腫瘤活性、抗氧化、降血糖、抗菌、抗病毒、提高免疫力等多方面表現(xiàn)出了優(yōu)秀的能力。不同的藥理作用與多糖的分子量及硫酸鹽的含量密切相關(guān)。

已有的羊棲菜多糖抗腫瘤活性的報告表明，它是通過增強機體的免疫調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，促進腫瘤抑制基因的表達和抑制腫瘤血管生成來實現(xiàn)的。

汲晨鋒課題組[27]的實驗結(jié)果表明，褐藻多糖(SFPS-B2)可以抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長，IC50為189.30μg·mL-1。促使細(xì)胞凋亡的作用主要表現(xiàn)在兩個方面：一方面，SFPSB2導(dǎo)致MPTP開放，導(dǎo)致Ca2+和Cyt-C釋放，Ca2+的增加促進了Cyt-C從線粒體釋放，釋放的Cyt-C進入細(xì)胞質(zhì)可激活Caspase-9，使Caspase-3酶活化，這將通過蛋白水解作用導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和功能紊亂，并最終通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另一方面，它可以上調(diào)Bax的表達，促進細(xì)胞凋亡因子的釋放，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。丁侃課題組從羊棲菜中提取了藻酸(04S2P)，并用氯磺酸-吡啶法，通過04S2P制備硫酸化藻酸(04S2P-S)。其抗腫瘤活性的研究結(jié)果表明，04S2P僅抑制腫瘤細(xì)胞Bel7402的增殖，而04S2P-S顯著抑制腫瘤細(xì)胞Bel7402、SMMC7721和Caco-2的增殖，表現(xiàn)出優(yōu)異的抗腫瘤活性。

佟海濱課題組[28]的研究顯示，褐藻多糖(cSFF)對P-選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附具有拮抗作用，而P-選擇素在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。后來又發(fā)現(xiàn)，羊棲菜多糖(SFPS)可抑制人肺癌細(xì)胞SPC-A-1的增殖。在體外和體內(nèi)裸鼠的肺癌細(xì)胞和異種腫瘤組織中，SFPS上調(diào)Ecadherin蛋白的表達并下調(diào)MMP2和MMP9的表達[29]，這表明其具有潛在的抗腫瘤作用。陳肖鳴課題組[30]提取了褐藻多糖(SFPS)來研究其體內(nèi)抗腫瘤活性。將HepG2細(xì)胞經(jīng)皮下注射到小鼠體內(nèi)，建立小鼠肝細(xì)胞癌模型，結(jié)果表明，SFPS顯著抑制腫瘤的生長，同時促進脾臟的生長，刺激HepG2細(xì)胞的凋亡。IC50為1158.6μg·mL-1，說明SFPS是一種潛在的肝癌輔助治療藥物，可通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，并在高濃度時具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的活性。之后，該課題組[31]發(fā)現(xiàn)，在接種了鼻咽癌CNE細(xì)胞的裸鼠模型中，SFPS也顯示出相似的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，并且該活性與TLR2/TLR4受體及p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。

陳惠玲等人[32]初步證實，褐藻多糖(FP08S2)在體內(nèi)和體外均具有顯著的血管生成抑制活性。在雞胚絨毛膜尿囊膜模型中，隨著藥物濃度增加，F(xiàn)P08S2顯著抑制新的毛細(xì)血管形成，同時血管密度更低，分支更少，管道直徑更細(xì)且很多結(jié)構(gòu)模糊，表明FP08S2可顯著抑制體外HMEC-1細(xì)胞的遷移和侵襲，并導(dǎo)致絲狀肌動蛋白解聚。FP08S2通過抑制內(nèi)皮生長因子(VEGF)的信號傳遞途徑和轉(zhuǎn)錄因子的表達，阻斷VEGF和VEGFR2之間的結(jié)合，并產(chǎn)生抗血管生成作用。此外，F(xiàn)P08S2是通過直接作用于A549而不是通過細(xì)胞毒性途徑或誘導(dǎo)凋亡，來阻止裸鼠中異種A549肺癌細(xì)胞的生長和微血管形成。羊棲菜多糖在體內(nèi)的抑制腫瘤作用呈現(xiàn)劑量依賴性，是通過阻礙相關(guān)蛋白表達進而使得細(xì)胞凋亡，而不是直接的細(xì)胞毒性造成腫瘤細(xì)胞死亡的。

此外，褐藻多糖還可以有效降低胞內(nèi)單線態(tài)氧、羥基自由基等氧化活性物種的水平[33-35]。抗氧化活性取決于降解后羊棲菜多糖的活性基團以及硫酸鹽基團的含量，多糖分子量的大小也直接影響其抗氧化能力。另外，羊棲菜多糖可以增強巨噬細(xì)胞的吞噬作用和自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性，促進免疫細(xì)胞的增殖和免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的活性，從而有效增強免疫力。在建立的小鼠模型中，小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、外周白細(xì)胞數(shù)量及胞內(nèi)谷胱甘肽水平都有不同程度的提高，對免疫器官具有一定的保護作用[36-40]。褐藻多糖在降血糖[41-42]、抗凝血[43-44]、抗衰老、抗病毒[45-47]、抗菌[48-49]、抗炎[50]、抗疲勞[51]、保護皮膚方面也有重要的作用。

4 總結(jié)

羊棲菜在我國的產(chǎn)量很高，多作為海洋蔬菜進入市場。近些年研究者對其藥理性質(zhì)進行了探索，在其含有的各種成分中，褐藻多糖表現(xiàn)出最強的藥理活性。褐藻多糖的藥理活性和其硫酸化的程度密切相關(guān)，因而在提取分離過程中，如何快速并完整地提取褐藻多糖是亟需解決的問題。超聲輔助法及微波法提取得到的褐藻多糖，其結(jié)構(gòu)相對完整。另外，

褐藻多糖的結(jié)構(gòu)仍不清楚，通過一維或二維同核(異核)NMR技術(shù)解析仍存在技術(shù)難題，目前未見到原子力顯微鏡(AFM)、電子順磁共振(EPR)、X射線衍射、X射線光電子能譜(XPS)等方法在羊棲菜多糖結(jié)構(gòu)分析方面的應(yīng)用。充分解析羊棲菜多糖的結(jié)構(gòu)，有助于理解其在發(fā)揮藥理活性時的作用機理，更好地發(fā)揮羊棲菜的藥用價值。