劉福林 ， 曹 紅 ， 王亞楠 ， 武沛澤 ， 海 偉 ，王宏鈞 ， 李 三 , 余德海 ， 陳福勇 ， 常建宇

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.四川天兆豬業(yè)股份有限公司 ， 重慶 渝北 401100)

禽白血病(Avian leucosis, AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)感染引起的，主要以造成被感染動物細(xì)胞惡性增生的腫瘤疾病為主要特征。根據(jù)囊膜蛋白抗原性的不同，ALV分為 A～J共10個亞群。其中在雞群中流行的 A、B、C、D四個亞群是1980年以前確定的，在雞群中誘發(fā)腫瘤的主要是 A、B亞群ALV。C、D亞群在臨床上少見，報道較少。E亞群則是普遍存在的內(nèi)源性禽白血病病毒，對宿主無致病性。F～I(xiàn)亞群ALV分離自雞以外的宿主動物，而J亞群是20世紀(jì)90年代初從肉雞中分離到的一種新型外源性病毒[1]。近年的ALV流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國禽白血病病原主要為J亞型，該病毒給養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[2-5]。目前國內(nèi)商業(yè)蛋雞、肉雞及地方品種雞都有感染禽白血病的報道[6-9]。

元寶雞作為名貴的觀賞雞，有一定的觀賞價值，它體型嬌小、生性活潑，深受世人喜愛。迎合全球發(fā)展微型特種禽的潮流，被譽為絕世珍品。國內(nèi)元寶雞養(yǎng)殖業(yè)剛剛起步，其經(jīng)濟效益是普通雞的3～4倍，國內(nèi)外市場潛力巨大，是高效農(nóng)業(yè)的新項目。目前國內(nèi)尚無關(guān)于其禽白血病方面的報道，因此對其進(jìn)行禽白血病的調(diào)查很有必要。本試驗從觀賞元寶雞血漿中分離1株禽白血病病毒，并命名為BJ1401。完成其全基因序列的測定，并將測序結(jié)果與已發(fā)表序列進(jìn)行同源性分析和制作進(jìn)化樹。本試驗為防控和凈化元寶雞雞群中禽白血病提供理論依據(jù)，并可豐富中國地方品種雞的分子流行病學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 血漿樣品來自于北京某觀賞禽交易市場，雞品種為元寶雞。禽白血病抗原檢測試劑盒為美國IDEXX產(chǎn)品。DF-1細(xì)胞由本實驗室保存。DMEM、FBS、胰酶，均購自Gibco公司。DH5α、克隆用PEGM-T載體、工具酶、組織/細(xì)胞DNA提取試劑盒，為北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 病毒的分離和鑒定 參照王笑梅的方法[10]，將待檢測的血漿樣品接種于DF-1，同時設(shè)DF -1細(xì)胞陰、陽性對照。細(xì)胞上清ALV p27抗原ELISA檢測按照抗原檢測試劑盒(IDEXX)使用說明書進(jìn)行。上清為陽性的樣品，細(xì)胞沉淀用于提取ALV前病毒基因組DNA。

1.3 ALV前病毒DNA的制備 收集陽性上清細(xì)胞沉淀，按照Genomic DNA Kit說明書制備ALV前病毒基因組DNA。

1.4 引物合成和基因組cDNA的PCR擴增 參考張青嬋的論文[11]合成5對連續(xù)且相互重疊覆蓋全序列的引物，引物序列見表1，以1.3中樣品為模板進(jìn)行PCR擴增。全部引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物核苷酸序列

1.5 核酸序列片段克隆和測序 取PCR已純化產(chǎn)物1 μL連入5 μL pEGM-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，選陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 核酸序列的相似性比較和進(jìn)化分析 應(yīng)用DNASTAR軟件，對6個PCR片段克隆的測序結(jié)果進(jìn)行拼接，將獲得的BJ1401株前病毒基因組核苷酸序列與國內(nèi)外公開發(fā)表的病毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化及相似性比較分析。參考毒株為： RAV-1 (A亞群代表株)、MQNCSU (A亞群美國株)、MAV-1、SDAU09C3 (A亞群中國株)，SDAU09C2 (B亞群中國株)，ev-1(E亞群代表株)、SDO501 (E亞群中國株), Prague C (C亞群代表株),RSV-SR-D (D亞群代表株), HPRS103(J亞群原始毒株)，基因庫登錄號依次為: M19113、DQ365814、L10922、HM452340、HM446005、AY013303、EF467236、J02342、D10652、Z46390。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離及鑒定 觀賞型元寶雞雞群的血漿接種DF1細(xì)胞后，經(jīng)過傳代獲得細(xì)胞上清，p27檢測為陽性，獲得1株外源ALV，命名為BJ1401。

2.2 BJ1401株基因組cDNA的PCR擴增 利用5對擴增cDNA的全基因組引物進(jìn)行PCR擴增，均擴增出了5段與預(yù)期大小相符的DNA片段(圖1)。

2.3 BJ1401株基因組序列結(jié)構(gòu) 利用DNASTAR軟件對BJ1401株的測序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得了其cDNA全序列。BJ1401株序列全長7 503 bp, 其中g(shù)ag基因長為2 106 bp；pol基因長為2 687 bp;env基因長為1 799 bp; 兩端相同的LTR均長為283 bp。

2.4 BJ1401株核苷酸序列比對 利用DNASTAR軟件分析表明，BJ1401株gag基因核苷酸與各亞群參考株同源性在95.5%～99.0%，與E亞群相似性最高(99.0%)。pol基因核苷酸與各亞群參考株同源性在97.3%～99.6%，與E亞群相似性亦最高(99.6%)。gp85基因核苷酸序列與C亞群Prague C株相應(yīng)核苷酸序列相似性最高(91.6%)，與J亞群原型株HPRS-103相似性最低(50. 3%)，與各代表株的核苷酸序列相似性在50.3%～91.6%。gp37核苷酸序列與E亞群同源性高達(dá)98.2%，與A、B、C、D亞群，相應(yīng)序列同源性在92.7%～94.3%，與J亞群同源性只有59.5%。LTR核苷酸序列與E亞群同源性最高(91.6%)，與其他各亞群同源性低于68.0%(表2)。

表2 BJ1401株各核苷酸片段與不同亞型毒株相應(yīng)核苷酸序列的同源性

2.5 BJ1401株核苷酸序列的進(jìn)化分析 利用MEGA6.0軟件對BJ1401株部分核苷酸片段進(jìn)行進(jìn)化分析表明，BJ1401株gp85核苷酸序列與C亞群美國株P(guān)rague C的親緣關(guān)系最近，與C亞群同在一個進(jìn)化支上，與J亞群ALV分離株相比，A、B、C和E亞群ALV分離株親緣關(guān)系較近，同屬一個大的進(jìn)化支(圖2)。gp37核苷酸序列與E亞群ev-1及SD0501株親緣關(guān)系最近，與E亞群同在一個進(jìn)化分支上(圖3)。LTR核苷酸序列與E亞群ev-1、SD0501株親緣關(guān)系亦最近(圖4)。

圖2 BJ1401株gp85基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 BJ1401株gp37基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 BJ1401株LTR基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

國內(nèi)己經(jīng)有很多關(guān)于禽白血病的報道，但主要集中在家禽上，尚無有關(guān)觀賞性元寶雞感染禽白血病的報道。本試驗報道了觀賞性元寶雞中存在禽白血病病毒的感染，由于目前樣本數(shù)量較少，不能有效計算其感染率，還需要進(jìn)一步加大樣本采集進(jìn)行檢測，并分析其基因特征，以便掌握元寶雞雞群中流行的禽白血病的分子特征。為確保我國具有經(jīng)濟價值的觀賞禽免受禽白血病等腫瘤疾病的侵害，我們應(yīng)掌握元寶雞中禽白血病的流行動態(tài)，以便采取相應(yīng)的保護(hù)和防控措施。

BJ1401株gag和pol基因核苷酸序列相對保守，但同源性顯示更接近于E亞群。gp85基因核苷酸序列與C亞群同源性最高，并且處在同一進(jìn)化分支上，gp37、LTR基因核苷酸序列與E亞群相應(yīng)序列同源性最高，且遺傳關(guān)系也最近。因此，僅從同源性和遺傳進(jìn)化角度分析，元寶雞中分離株BJ1401很可能是C亞群E亞群禽白血病病毒重組的結(jié)果。雖然BJ1401株具有內(nèi)源性E亞群的全基因主干，但它具有外源性病毒的gp85基因，因此可以在DF-1細(xì)胞上感染和增殖。

我國地域遼闊，氣候地理條件多種多樣，各地飼養(yǎng)著許多不同特性和不同遺傳背景的地方品系雞群。長期以來，這些雞群可能一直存在著ALV感染，但從來都沒有做過ALV的凈化，地方品系雞存在不同基因組結(jié)構(gòu)的ALV的可能性就很大。因此，本試驗從我國觀賞性雞群中分離1株不同于己知6個亞群ALV的基因結(jié)構(gòu)就不足為奇了。但是，對于該毒株對雞的致病性及其生物學(xué)特性有待進(jìn)一步研究。