陳 云 李周勇 史玉東 王 然 王辰元 趙 亮*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京100083 2 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司研發(fā)中心 呼和浩特011500 3 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 北京100083）

隨著消費(fèi)者生活水平的提高，對食品的需求不再僅限于數(shù)量，而更關(guān)注健康[1]。發(fā)酵乳制品具有調(diào)節(jié)腸道菌群，提高免疫力，預(yù)防癌癥等功能[2-3]，其消費(fèi)比重不斷增加。發(fā)酵劑是發(fā)酵乳制品生產(chǎn)的關(guān)鍵。發(fā)酵劑一般具備兩種性能，即生產(chǎn)性能（包括產(chǎn)香性、產(chǎn)粘性、產(chǎn)酸性、蛋白分解活力及乳糖分解性能）和益生特性（降血脂，免疫調(diào)節(jié)，降血壓等）[4-6]，對兼具生產(chǎn)和益生功能的菌株[7]的開發(fā)是未來發(fā)酵乳制品的研究方向。

我國地緣遼闊，不同地域的自然環(huán)境和氣候條件，造就了特色各異的傳統(tǒng)自然發(fā)酵乳制品[8]，如：酸牛乳、酸馬奶、酸羊奶、酸駝奶等。這些民族傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌經(jīng)過千百年的自然選擇與進(jìn)化，一些具有優(yōu)良發(fā)酵特性和益生作用的乳酸菌被保留下來。不同少數(shù)民族在制備傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品時(shí)所用的原料、工藝等不同，使我國乳酸菌資源具有生物多樣性和基因多樣性[9]。

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）MNBM-A01 是從甘南藏族自治州地區(qū)自然發(fā)酵酸乳中分離獲得的一株高產(chǎn)胞外多糖嗜熱鏈球菌菌株，該菌株具備良好的產(chǎn)酸、產(chǎn)粘和產(chǎn)香特性，具備作為發(fā)酵劑的良好特征[10]。為進(jìn)一步研究該菌株的益生功能，本文以小鼠為模型，研究其免疫調(diào)節(jié)作用，為該菌株的工業(yè)應(yīng)用和開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：嗜熱鏈球菌MN-BM-A01，保藏號CGMCC No.11383，分離自甘肅省甘南藏族自治州舟曲縣拱壩鄉(xiāng)傳統(tǒng)制作方法發(fā)酵的酸牛奶中。MN-BM-A01 菌株在12%脫脂乳培養(yǎng)基中活化3代，以2%的接菌量接種于12%脫脂乳，于37 ℃培養(yǎng)18 h，利用0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）調(diào)整其菌數(shù)為1.0×109CFU/mL，按用量分裝4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)動物：清潔級昆明小鼠，雄性，平均體重（20±2）g，144 只，內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心。

試 劑：0.01 mol/L、pH 7.4 PBS；DEPC 水、氯仿、75%乙醇，北京陸橋技術(shù)有限公司；小鼠sIgA ELISA 試劑盒、小鼠IgG ELISA 試劑盒、小鼠IgM ELISA 試劑盒、小鼠LYZ ELISA 試劑盒，美國GBD 公司；NK 細(xì)胞活性檢測WST-8 試劑盒，日本D0JINDO 公司；動物組織總RNA 提取試劑盒，德國QIAGEN 公司；其余試劑均為分析純級。

1.2 儀器及設(shè)備

ELX808 酶標(biāo)儀、ELX50 洗板機(jī)，美國Biotek公司；超凈工作臺，新加坡ESCO 公司；CP21GⅡ高速冷凍離心機(jī)，日立公司；恒溫培養(yǎng)箱（37，43℃），西班牙J.P.SELECTA 公司；Premium U410 超低溫冰箱，美國NBS 公司；G560E 漩渦混合器，美國SCIENTIFIC Instruments 公司；電子稱，梅特勒公司；HV-110 高壓滅菌鍋，日本Hirayama 公司；Sartorius pH 計(jì)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及飼喂方式 實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，待體重均達(dá)（20±2）g 后將小鼠隨機(jī)分為4 組，分組飼喂，自由飲水，自由采食。試驗(yàn)組小鼠每日1 次灌胃，對照組以同樣的方法給予生理鹽水，連續(xù)30 d。飼喂前1 天收集糞便；最后1天收集糞便，各指標(biāo)檢測時(shí)按各自飼養(yǎng)時(shí)間要求取小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[11]，小鼠分組及飼喂方式如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及飼喂方式（飼喂30 d）Table 1 The experimental group and feeding way （feeding 30 days）

1.3.2 小鼠體重及免疫臟器指數(shù) （Immune organ index，IOI）測定[12]飼喂期間每隔10 d 測量體重1 次，計(jì)算平均體重，繪制體重變化曲線。分別在飼養(yǎng)14 d 及28 d 時(shí)，處死小鼠，無菌取出胸腺和脾臟，將周圍組織剝離干凈，用濾紙吸凈組織表面血液后稱重，按式（1）計(jì)算免疫臟器指數(shù)。

1.3.3 小鼠血清中IgG、IgM 含量測定[12]14 d 灌胃后的第2 天，摘除眼球取血于離心管中，待析出血清時(shí)，于3 000×g 離心15 min，上清液分裝于管中，然后封口置于-20 ℃低溫保存，待測。用免疫球蛋白（IgG、IgM）ELISA 試劑盒檢測，具體步驟按照試劑盒說明書完成。

1.3.4 小鼠糞便中sIgA 含量的測定 收集7 d 和14 d 老鼠糞便，用PPST 溶解，3 000×g 離心去除雜物，用sIgA ELISA 試劑盒檢測sIgA 含量，具體步驟按照試劑盒說明書完成。

1.3.5 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)[13]當(dāng)T 細(xì)胞受ConA（刀豆蛋白）刺激后發(fā)生母細(xì)胞增值反應(yīng)，活細(xì)胞特別是增值細(xì)胞中的線粒體水解酶可將MTT （一種淡黃色唑氮鹽）分解為藍(lán)紫色結(jié)晶，其光密度值能反應(yīng)出細(xì)胞增值情況。

試驗(yàn)方法：取脾臟，分離出淋巴細(xì)胞，利用MTT 試劑盒進(jìn)行測定。ConA 孔的光密度值減去不加ConA 孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增值能力。受試樣品吸光值差值顯著高于對照組（P＜0.05），判定陽性。

1.3.6 血清溶血素測定[14]用SRBC 免疫動物后，血清中出現(xiàn)SRBC 抗體（溶血素），在補(bǔ)體參與下，與SRBC 一起孵育，可發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白，通過測定血紅蛋白含量反映動物血清中溶血素的生成水平（HC50）。

綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中搖動脫纖維，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取羊血，用生理鹽水洗滌3 次，離心。將積壓SRBC用生理鹽水配成細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2 mL 進(jìn)行免疫，4～5 d 后，收集血清。取血清用SA緩沖液稀釋并置于試管內(nèi)，依次加入SRBC、補(bǔ)體。另設(shè)不加血清的對照管（以SA 緩沖代替），水浴后離心，取上清液，加都氏試劑，同時(shí)取體積分?jǐn)?shù)10%的SRBC 加都氏試劑，充分混勻，于540 nm 波長處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。

1.3.7 碳廓清試驗(yàn)[15]在一定范圍內(nèi)，小鼠體內(nèi)碳顆粒被清除速率與血碳濃度成指函數(shù)關(guān)系。以血碳為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，兩者呈直線關(guān)系。此直線率K 表示吞噬率。動物肝臟、脾臟影響吞噬率，一般以矯正吞噬指數(shù)a 表示。

小鼠尾靜脈注射稀釋的印度墨汁，按每10 g質(zhì)量0.1 mL 計(jì)算。待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)，注入墨汁后2，10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并將其加到2 mL Na2CO3溶液中。在600 nm 波長處測光密度值（OD600nm），以Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱質(zhì)量。

式中，OD1，OD2——分別為反應(yīng)10，20 min 時(shí)的光密度值；t2，t1——分別為10，20 min。

受試樣品吞噬指數(shù)a 顯著高于對照組 （P＜0.05），判定陽性。

1.3.8 NK 細(xì)胞活力檢測[16]正常情況下，細(xì)胞中LDH 不能透過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到NK 細(xì)胞殺傷后LDH 釋放到胞外。而LDH 可將MTT 分解成藍(lán)色顆粒，且顆粒生成量與活細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活化狀態(tài)呈線性關(guān)系。

脾臟分離出NK 細(xì)胞與YAC-1 淋巴瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，利用CCK-8 試劑盒檢測NK 細(xì)胞活力。

受試樣品的NK 細(xì)胞活力顯著高于對照（P＜0.05），判定陽性。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS17.0 對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重及免疫臟器指數(shù)

2.1.1 小鼠體重 在規(guī)定飼養(yǎng)時(shí)間檢測各組小鼠體重變化，其結(jié)果如表2所示。

表2 小鼠體重變化（n=12）Table 2 The change of body weight in mice （n=12）

由表2可知，4 個(gè)試驗(yàn)組小鼠體重隨飼養(yǎng)時(shí)間延長逐漸升高。采用SPSS17.0 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，不同試驗(yàn)組在不同飼養(yǎng)時(shí)期，組間無顯著差異。說明MN-BM-A01 低、中、高劑量組不影響小鼠體重增長。試驗(yàn)期間，各組小鼠健康狀況良好，無腹瀉、增肥等不良現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)小鼠有中毒或自然死亡。

表3 脾臟指數(shù)（mg/g）Table 3 The spleen index （mg/g）

2.1.2 免疫臟器指數(shù) 小鼠免疫臟器指數(shù)測定結(jié)果如表3及表4所示。

表4 胸腺指數(shù)（mg/g）Table 4 The thymus index （mg/g）

由表3可以看出，14 d 后，MN-BM-A01 低劑量組、中劑量組及高劑量組脾臟指數(shù)與對照組相比顯著提高（P＜0.05）。28 d 后，低劑量組與對照組無顯著差異，中劑量組和高劑量組與對照組相比顯著提高（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，MN-BM-A01對14 d 小鼠脾臟指數(shù)有顯著影響，而隨著時(shí)間延長會逐漸減弱，到28 d 時(shí)，低劑量組對小鼠脾臟指數(shù)影響不顯著。

由表4可以看出，14 d 及28 d 后，低劑量組、中劑量組及高劑量組胸腺指數(shù)與對照組相比，均無明顯差異。表明MN-BM-A01 對小鼠胸腺指數(shù)影響不顯著。

2.2 血清IgG 及IgM 含量

小鼠血清中IgG 及IgM 含量測定結(jié)果如表5所示。

由表5可以看出，MN-BM-A01 低劑量組、中劑量組、高劑量組血清中IgG 含量均顯著高于對照組（P＜0.05），各劑量組間無顯著差異。結(jié)果表明，MN-BM-A01 可以有效提高血清中IgG 含量。

MN-BM-A01 中劑量組、高劑量組血清中IgM含量顯著高于對照組（P＜0.05），低劑量組血清中IgM 含量與對照組無明顯差異。同時(shí)，中劑量組和高劑量組血清中IgM 含量顯著高于低劑量組（P＜0.05）。表明MN-BM-A01 的中高劑量可以有效提高血清中IgM 的含量，而低劑量對血清中IgM 含量影響不顯著。

2.3 小鼠糞便中sIgA 含量

小鼠糞便中sIgA 含量測定結(jié)果如表6所示。

由表6可以看出，MN-BM-A01 高劑量組糞便中sIgA 含量顯著高于對照組（P＜0.05）；低劑量組和中劑量組小鼠糞便中的sIgA 含量與對照組相比差異不顯著。

表5 血清中IgG 及IgM 含量測定結(jié)果Table 5 The determination results of serum IgG and IgM content

2.4 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化

試驗(yàn)對MN-BM-A01 3 個(gè)劑量組進(jìn)行了淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，其結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，低劑量組光密度值差為0.41，經(jīng)t 檢驗(yàn)后表明與對照組0.36 無明顯差異。中劑量組和高劑量組光密度值差均顯著高于對照組（P＜0.05）。由于有中、高兩個(gè)劑量組顯著高于對照組，小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（細(xì)胞免疫）結(jié)果為陽性。MN-BM-A01 可以顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖。

2.5 血清溶血素

試驗(yàn)對MN-BM-A01 3 個(gè)劑量組進(jìn)行血清溶血素測定，通過測定血紅蛋白含量反映動物血清中溶血素的生成水平 （HC50）。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

表6 糞便中sIgA 測定結(jié)果Table 6 Faeces sIgA determination results

由圖2可以看出，MN-BM-A01 低劑量組HC50為19.42，中劑量組為20.16，高劑量組為21.33，經(jīng)t 檢驗(yàn)，結(jié)果表明，各劑量組與對照組（18.24）均無明顯差異。由于3 個(gè)劑量組中沒有一個(gè)劑量組顯著高于對照組，小鼠血清溶血素測定試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.6 碳廓清試驗(yàn)

試驗(yàn)對MN-BM-A01 低、中、高3 個(gè)劑量組進(jìn)行了碳廓清試驗(yàn)，并與對照組進(jìn)行對比，其結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，MN-BM-A01 低、中、高劑量組碳廓清指數(shù)分別為0.59，0.65 和0.78，均顯著高于對照組的0.33（P＜0.05）。因此，小鼠碳廓清試驗(yàn)結(jié)果為陽性。結(jié)果證實(shí)MN-BM-A01 顯著提高小鼠吞噬細(xì)胞吞噬能力。

2.7 NK 細(xì)胞活力

小鼠NK 細(xì)胞活力測定結(jié)果如圖4所示。

圖1 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力Fig.1 The lymphocyte transformation capability

由圖4可知，MN-BM-A01 3 個(gè)劑量組中，低劑量組與中劑量組NK 細(xì)胞活力與對照組無明顯差異；高劑量組NK 細(xì)胞活力為22.16，顯著高于對照組（12.05），P＜0.05。結(jié)果顯示，MN-BM-A01高劑量顯著提高小鼠NK 細(xì)胞殺傷活性。

圖2 半數(shù)溶血值測定結(jié)果Fig.2 Half hemolysis value determination results

圖3 碳廓清指數(shù)Fig.3 The carbon clearance index

圖4 NK 細(xì)胞活力Fig.4 NK cells activity

3 結(jié)論

以清潔級雄性昆明小鼠為動物模型，對MNBM-A01 菌株的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行試驗(yàn)評價(jià)。結(jié)果顯示：飼喂MN-BM-A01 菌株的小鼠健康狀況良好，可以有效提高血清中IgG、IgM 的含量以及小鼠糞便中sIgA 的含量，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，提高吞噬細(xì)胞和NK 細(xì)胞活力。MN-BM-A01 菌株具有增強(qiáng)小鼠免疫力的作用。