梁 慧，卜堅(jiān)珍，馮衛(wèi)華 ，于立梅*，廖志強(qiáng)

(1.江門市第一職業(yè)高級(jí)中學(xué) 商旅部，廣東 江門 529000 ; 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225)

藍(lán)莓(Vaccinium Spp)又名篤斯越橘，屬于杜鵑花科(Ericaceae)，越橘屬(Vaccinium)，小果類果樹品種之一，廣泛分布于世界各地。藍(lán)莓VC含量很高， 是蘋果的幾十倍，被譽(yù)為“漿果之王”。還富含維生素E、A、B1及SOD、熊果甙、花青甙、蛋白質(zhì)、脂肪等其他果品中稀有的特殊成分及豐富的鐵、鋅、錳等微量元素，具有防止腦神經(jīng)衰老、加強(qiáng)心臟功能、明目抗癌等獨(dú)特功效，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織確定為人類五大健康食品之一[1-4]。但是，藍(lán)莓成熟期為每年的6—8月，由于氣溫比較高，常溫長時(shí)間放置容易導(dǎo)致果實(shí)腐爛。因此，有必要對(duì)藍(lán)莓鮮果進(jìn)行深加工，以延長藍(lán)莓制品的生產(chǎn)周期。隨著國內(nèi)消費(fèi)市場的高速增長，藍(lán)莓果酒的市場發(fā)展?jié)摿薮?。陳亮等[5]研究了發(fā)酵期間藍(lán)莓果酒總酚含量、花色苷含量、自由基清除率以及還原力的變化并進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果證明，由于酵母菌的作用各項(xiàng)指標(biāo)總體顯現(xiàn)下降趨勢。薛桂新等[6]研究了在發(fā)酵期間，不同藍(lán)莓添加量的復(fù)合果酒的抗氧化活性有所差異。結(jié)果表明：藍(lán)莓添加量為10%的復(fù)合果酒其抗氧化能力最佳，雖然目前對(duì)藍(lán)莓果酒的抗氧化性活性的研究已有報(bào)道，但在藍(lán)莓果酒工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)其發(fā)酵期間的抗氧化活性的研究上尚不多見。因此，以藍(lán)莓為試材，通過對(duì)酵母(Saccharomyces)的發(fā)酵篩選，發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化，生產(chǎn)出酒精度較低、口味酸甜度適宜的保健型含酒精飲品，并研究其抗氧化活性，為藍(lán)莓酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

兔眼藍(lán)莓購自樹果悅濃水果旗艦店；安琪果酒專用酵母RV002、RW、SY、BV818、RV171，安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)； 果膠酶(酶活力：26 000 PG/mL)，諾維信公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1工藝流程

藍(lán)莓→篩選、沖洗→粉碎勻漿→ 0.02%果膠酶酶解→酶失活→調(diào)節(jié)糖度、pH值→加入偏重亞硫酸鉀→加入酵母菌→前期發(fā)酵→濾去果渣→后期發(fā)酵→澄澈→藍(lán)莓果酒

1.2.2發(fā)酵單因素試驗(yàn)

1.2.2.1酵母種類對(duì)發(fā)酵的影響

選擇RV002、RW、SY、BV818、RV171五種安琪葡萄酒專用酵母，35 ℃溫水活化30 min。酵母接種量為0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，固定溫度20 ℃，糖度20%，偏重亞硫酸鉀添加量80 mg/L，pH值4.0，以酒精度(酒精體積分?jǐn)?shù))為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定酵母種類。

1.2.2.2酵母添加量對(duì)發(fā)酵的影響

選擇0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%添加量，固定溫度20 ℃，糖度20%，偏重亞硫酸鉀添加量80 mg/L，pH值4.0，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定酵母添加量。

1.2.2.3偏重亞硫酸鉀對(duì)發(fā)酵的影響

選取0、40、80、120、160 mg/L偏重亞硫酸鉀添加量，固定溫度20 ℃，糖度20%， pH值4.0，酵母添加量0.8%，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定偏重亞硫酸鉀添加量。

1.2.2.4pH值對(duì)發(fā)酵的影響

選取pH值3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，固定發(fā)酵溫度20 ℃，糖度20%，酵母接種量為0.8%，偏重亞硫酸鉀添加量80 mg/L，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定pH值范圍。

1.2.2.5初始糖度對(duì)發(fā)酵的影響

選取18%、20%、22%、24%、26%糖度，固定在溫度20 ℃，酵母接種量為0.8%，偏重亞硫酸鉀添加量80 mg/L，pH值4.0，發(fā)酵期限7天，把酒精度作為評(píng)判指標(biāo)，確定初始糖度。

1.2.3主發(fā)酵多因素試驗(yàn)

溫度為20 ℃，選擇試驗(yàn)因素：初始糖度、SO2添加量、酵母添加量、pH值，采用L9(43)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，把酒精度及感官評(píng)價(jià)當(dāng)作評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定藍(lán)莓果酒發(fā)酵工藝的最佳值。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1酒精度檢測

參考國標(biāo)GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行操作[7]。

1.3.2感官評(píng)價(jià)的測定

參考國標(biāo)GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行感官測定[7]。

1.3.3DPPH自由基清除能力測定

藍(lán)莓酒的DPPH自由基清除能力參照CALLISTE等的方法在第1、3、5、7、9取樣測定，以等量的超純水當(dāng)作空白對(duì)照[8]。

DPPH自由基清除率(%)=(1-As/A0) ×100%

其中：As為樣品管的吸光值，A0為對(duì)照管的吸光值。

1.3.4FRAP值的測定

測定參照BENZIE[9]的方法，以EC1值作為樣品鐵還原能力評(píng)價(jià)指標(biāo)，EC1值指與1 mmol/LFeSO4·7H2O有同等抗氧化能力的樣品的量。

加入18 mg/L的硫酸0.25 mL，再加水稀釋至50 mL定容，并置入小鐵釘。于第1、3、5、7、9天測藍(lán)莓果酒的FRAP值，以超純水為空白對(duì)照，在593 nm下測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析和作圖采用Excel 2007，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差作為試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓果酒發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.1.1酵母菌種類對(duì)藍(lán)莓果酒酒精度的影響

果酒的釀造過程即酵母將果汁中的糖分轉(zhuǎn)化為乙醇的過程，使果酒酒精度逐漸上升。5種酵母菌在發(fā)酵前期使果酒酒精度增加幅度較大，后期影響緩慢，最終趨于穩(wěn)定。這可能是由于酵母菌繁殖至指數(shù)生長期后，菌體生長出現(xiàn)了衰弱現(xiàn)象，其將糖分轉(zhuǎn)化為乙醇的能力下降，見表1[10-11]。

表1 酵母菌種類對(duì)藍(lán)莓果酒酒精度的影響

由表1可知，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，5種酵母菌發(fā)酵藍(lán)莓酒精度在9.8%～13.8%。酵母RW發(fā)酵的酒精度較高，說明酵母RW較其他酵母利用藍(lán)莓汁中糖類物質(zhì)的能力較強(qiáng)，因此最終篩選出釀造藍(lán)莓果酒的最佳酵母為RW。

2.1.2酵母添加量對(duì)藍(lán)莓果酒酒精度的影響(見圖1)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

由圖1可知，隨著接種量的增加，酒精度呈先增后減的趨勢，接種酵母的量為0.6%時(shí)，酒精度達(dá)到最大值14.8% ，與其他幾組酒精度變化差異顯著(P<0.05)。在較高接種量下，酒精產(chǎn)量下降?？赡苁且?yàn)楹线m的接種量有利于縮短發(fā)酵周期，提高果酒的質(zhì)量，當(dāng)接種量過大時(shí)，微生物繁殖需要發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)，并在增殖過程中產(chǎn)生大量的代謝物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞過早老化、自溶等，而不利于后期酒精發(fā)酵[8]。因此選擇酵母添加量為0.4%～0.8%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3偏重亞硫酸鉀對(duì)藍(lán)莓果酒酒精度的影響(見圖2)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

由圖2可知，5個(gè)梯度的偏重亞硫酸鉀添加量中，添加量為80 mg/L時(shí)其殘?zhí)橇孔畹停凭冗_(dá)到最大14%。而添加量為0和160 mg/L時(shí)，殘?zhí)橇孔罡?，酒精度較低，果酒的風(fēng)味不佳，略帶苦澀。原因是SO2質(zhì)量濃度過低時(shí)，雜菌易污染且易與酵母菌增長形成競爭作用，酵母菌將糖轉(zhuǎn)化為酒精的能力較其他添加量弱，但是當(dāng)SO2的濃度過高時(shí)，酵母菌無法處于適合的生長環(huán)境，自身的代謝活動(dòng)會(huì)受到抑制，酵母菌將糖轉(zhuǎn)化為酒精的效率也會(huì)偏低[12]。因此，選擇偏重亞硫酸鉀添加量為40～120 mg/L進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.4pH值對(duì)藍(lán)莓果酒酒精度的影響(見圖3)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

由圖3可知，當(dāng)pH值為4.5時(shí)，藍(lán)莓發(fā)酵果酒的酒精度達(dá)到最大，體積分?jǐn)?shù)為13.8%。pH值為3.0時(shí)，發(fā)酵后的藍(lán)莓果酒酒精度偏低，而pH值為5.0時(shí)，主發(fā)酵7天后，耗糖量最少且酒精度最低。因?yàn)樗釙?huì)影響酵母的生長速度，酵母本身有一個(gè)最適pH值的生長環(huán)境。pH值過低或過高都會(huì)抑制酵母的生長，從而降低糖類轉(zhuǎn)化為酒精的效率。綜合上述原因，選擇pH值為3.5～5.0。

2.1.5初始糖度對(duì)藍(lán)莓果酒酒精度的影響(見圖4)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

由圖4可知，在主發(fā)酵階段的前3天中，初始糖量越大，糖分消耗得越快，而4天后，消耗糖分的速度減慢。初始糖含量高，有利于微生物生長代謝，酒精度升高，雖然微生物的生長需要足夠的碳源和氮源等營養(yǎng)物質(zhì)，但如果糖含量呈現(xiàn)富余狀態(tài)，造成培養(yǎng)液的滲透壓過大，會(huì)使微生物細(xì)胞快速脫水，打破微生物的代謝穩(wěn)定，造成細(xì)胞的活力下降，不利于其生長與發(fā)酵。同時(shí)過多的糖分會(huì)影響果酒的風(fēng)味和消費(fèi)者的接受程度[13]。因此選擇糖添加量20%～24%。

2.2 主發(fā)酵工藝參數(shù)在藍(lán)莓果酒中的優(yōu)化

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 發(fā)酵工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，根據(jù)藍(lán)莓發(fā)酵酒酒精度的程度為A>C>D>B，即初始糖度>酵母接種量>pH值>偏重亞硫酸鉀，理論最佳組合為A3B1C3D1，實(shí)驗(yàn)組中最優(yōu)為A3B1C3D2，因此需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到A3B1C3D2組合酒精度體積分?jǐn)?shù)最高，因此最佳發(fā)酵工藝方案為A3B1C3D2，即含糖量為24%，偏重亞硫酸鉀添加量為40 mg/L，酵母接種量為0.8%，pH值為4.0時(shí)，即為藍(lán)莓果酒的最佳工藝條件。

2.3 藍(lán)莓果酒的抗氧化活性

2.3.1藍(lán)莓果酒發(fā)酵期間的DPPH自由基清除活性(見圖5)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

由圖5可知，藍(lán)莓果酒第1天 DPPH自由基清除率為44.4%，其隨著儲(chǔ)藏天數(shù)的增加，清除率逐漸降低，抗氧化能力也隨之降低，7天后逐漸趨于穩(wěn)定，清除率穩(wěn)定在15%左右，9天后，自由基清除能率降低了29%，下降趨勢顯著。研究表明，發(fā)酵過程中果酒中花色苷和總酚含量會(huì)下降，導(dǎo)致活性下降[14-15]?？赡苡捎诨钚越湍赴l(fā)酵產(chǎn)生大量次級(jí)代謝產(chǎn)物與花色苷及總酚反應(yīng)生成衍生物，或花色苷的水解[16]。藍(lán)莓受到微生物酶的影響，其細(xì)胞壁分離同時(shí)放出蛋白質(zhì)、糖苷等成分，除此之外，以及DPPH自由基清除能力也受到發(fā)酵液pH值、乙醇濃度及溫度等的影響，使其呈現(xiàn)下降的趨勢。

2.3.2藍(lán)莓果酒發(fā)酵期間的FRAP值(見圖6)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

由圖6可知，利用FRAP法測定藍(lán)莓發(fā)酵液的抗氧化活性呈下降的趨勢，第1 天的FRAP值69.1 mmol/L，第9天35.4 mmol/L，總體下降了33.7 mmol/L。試驗(yàn)表明：藍(lán)莓果酒隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，其FRAP值逐漸減小，抗氧化能力下降。王秀菊[17]研究了藍(lán)莓總酚、花色苷及抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓的FRAP值、DPPH自由基清除力以及總酚含量具有極顯著相關(guān)性，但與花色苷含量相關(guān)性不顯著。由此可見，藍(lán)莓果酒的抗氧化活性與多酚物質(zhì)有關(guān)。許多研究驗(yàn)證，隨著果酒儲(chǔ)藏過程的延長，存在果酒中的一些主要游離態(tài)酚酸和單體酚含量都呈差異性下降趨勢，能夠生成酚酸衍生物和花色苷衍生物[18]?；ㄉ战M分的減少是導(dǎo)致其還原力下降的根本原因。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)獲得藍(lán)莓果酒的工藝參數(shù)為：最佳菌種酵母菌RW，初始糖量24%，偏重亞硫酸鉀含量40 mg/L，酵母添加量0.8%，pH值為4.0。該工藝制作出的藍(lán)莓果酒顏色為紫紅色；澄清明澈，香味地道且甘甜醇厚的口味，具有藍(lán)莓果酒突出的典型風(fēng)格。運(yùn)用DPPH法和FRAP法測定藍(lán)莓果酒的抗氧化能力，結(jié)果顯示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，藍(lán)莓果酒的氧化活性逐漸降低，最終趨于穩(wěn)定。王鶴霖等[19]也發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓籽瓜果酒，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，其抗氧化活性后期較穩(wěn)定；也與薛桂新[6]研究的藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒抗氧化結(jié)果相似；為后期果酒發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化、分析以及營養(yǎng)保健方面提供了參考價(jià)值。